长链非编码RNA在骨关节炎中的作用

陶诗聪 郭尚春 张长青



长链非编码RNA在骨关节炎中的作用

陶诗聪 郭尚春 张长青

长链非编码RNA(LncRNA)在软骨发育及骨关节炎(OA)病理进程中起到了重要的调控作用。LncRNA可以调控软骨细胞增殖、分化和凋亡，影响软骨细胞外基质分泌，通过调控基质金属蛋白酶分泌影响软骨细胞外基质降解，参与软骨炎症反应，在软骨退行性变的发生发展中发挥重要作用。该文就LncRNA在OA发生发展中的作用作一综述。

长链非编码RNA；骨关节炎；表观遗传

随着人类基因组计划的顺利完成，学者们发现转录组的复杂性远远超过以往的认知。人类转录组分为翻译蛋白质的编码RNA(即信使RNA，mRNA)和非编码RNA(ncRNA)，它们在生理和病理情况下都发挥着重要的功能[1]。人类基因组中只有1.5%的序列被转录成mRNA，而大多数转录为ncRNA。ncRNA一度被视为没有功能的RNA，但随着研究的深入，学者们认识到ncRNA在疾病进程中也发挥着相当重要的作用[2]。长链非编码RNA(LncRNA)是ncRNA的亚类，长度大于200个核苷酸，在细胞的多种功能中发挥着至关重要的作用[3]。大部分LncRNA表达量较低，常位于核内，较mRNA有更强的组织特异性、细胞类型特异性和亚细胞分布特异性[1,4]。

关节软骨是一种透明软骨，其来源于中胚层的间充质干细胞(MSC)[5]，由MSC增殖、分化为软骨细胞，并分泌细胞外基质(ECM)。软骨ECM主要由Ⅱ型胶原、蛋白多糖、蛋白聚糖组成[6]。骨关节炎(OA)是一种关节软骨慢性退行性病变，它可以由衰老、肥胖、心血管疾病、糖尿病、机械损伤等原因引起[7]。近年来LncRNA在调控软骨分化及OA进程中的作用初步展现，可作为未来治疗OA的潜在靶点。

1 LncRNA命名与分类

学者们根据功能和特征对LncRNA进行命名[8]，例如抗分化非编码RNA(DANC)、骨形成蛋白-2与成骨蛋白-1应答基因(BORG)、X失活特异转录物(XIST)、转化生长因子-β诱导同源异形盒A转录本 (LncRNA-HIT)、同源异形盒转录本反义RNA(HOTAIR)、同源异性盒A末端转录本(HOTTIP)、特异性生长抑制基因5(GAS5)、软骨损伤相关长链非编码RNA(LncRNA-CIR)、机械应力相关长链非编码RNA(LncRNA-MSR)、母系印迹表达转录本(H19)、p50相关环氧化酶-2基因外RNA(PACER)、软骨细胞炎症相关基因间长链非编码RNA(CILinc，包括CILinc01和CILinc02)、母系表达基因3(MEG3)、减数分裂增多2-相似假基因2(PMS2L2)、心肌梗死相关转录本(MIAT)[9-19]。

根据GENCODE分类可将功能、特征不明确的LncRNA分为5种亚类(图1)[20-21]。①反义：序列覆盖mRNA的外显子序列，但来自于反义链，命名方式为对应基因名加“-AS”后缀，例如HIF1A-AS1、ZBED3-AS1、KCNK15-AS1。②基因间长链非编码RNA(LincRNA)：来自编码基因间隔区的LncRNA，用“Linc”命名，例如LINC00152、LINC01589、LincRNA-UFC1[22]。③覆盖：此Lnc-RNA序列包含1个编码或非编码基因，命名方式为包含的基因名加“-OT”后缀，例如SOX2-OT。④内含：此LncRNA序列属于1个基因的内含子，命名以所在基因名加“-IT”后缀，例如SPRY-IT1。⑤加工转录物：此LncRNA没有开放阅读框(ORF)，且不属于上述4种亚类。

对于功能、特征不明确且暂未归类的LncRNA，可使用Ensembl数据库提供的真核生物基因组自动诠释系统来命名，称为ENSG编号，例如ENSG00000260114。

除规范命名外，部分LncRNA还拥有别名，例如ENSG00000260114的别名为CTD-2574D22.4、KCNK15-AS1的别名为RP11-445H22.4、LINC01589的别名为CTA-941F9.9。

图1 LncRNA的GENCODE分类

2 LncRNA特点

近年来，学者们通过转录组研究发现LncRNA比mRNA具有更加特异的表达谱，在不同的细胞、组织之间以及不同的发育阶段、疾病的不同阶段均具有不同的表达[23-25]。同时，LncRNA表达谱与mRNA表达谱密切相关，提示LncRNA很可能是基因表达网络中的共调控基因[26]。

许多LncRNA具有特异的亚细胞定位(图2)，例如XIST位于失活的X染色体、MIAT位于亚核结构域[27]、BORG位于细胞核[28]、GAS5位于细胞质[29]。

图2 常见的LncRNA定位

3 LncRNA作用机制

LncRNA可以通过一级结构、二级机构和三级结构来发挥各种功能。它通过折叠成独特的构象并与DNA、RNA或蛋白发生相互作用来调控基因表达(图3)。

3.1 对转录过程进行调控

LncRNA对转录过程的调控如下。①调控RNA聚合酶Ⅱ[30]：LncRNA与RNA聚合酶Ⅱ结合后，抑制其与DNA相结合过程，从而抑制转录。②调控转录前起始复合体[31]：LncRNA通过结合于编码基因的上游启动子区域干扰转录前起始复合体形成，从而抑制转录。

3.2 对细胞核结构进行调控

LncRNA对细胞核结构的调控如下。①对染色质进行修饰[32]：LncRNA通过形成染色质修饰复合体对染色质中的组蛋白进行修饰(甲基化、乙酰化等)，增强或抑制修饰的染色质区域转录活性。②调控核小体重塑[33]：真核生物细胞核中，DNA环绕着由4种组蛋白组成的八聚体，形成核小体结构，紧密状态下的DNA无法执行转录功能，而核小体重塑过程将DNA从核小体上松解开，以便完成转录功能，LncRNA在核小体重塑过程中发挥重要作用，从而参与转录活性的调控。③构成亚核结构域[34-35]：在细胞分裂间期，LncRNA参与亚核结构域的形成，并通过亚核结构域影响转录。

3.3 通过转录因子调控

LncRNA通过转录因子调控过程如下。①激活转录因子[36-37]：LncRNA与转录因子结合，增强转录因子对目标DNA片段的亲和力，从而促进下游基因转录。②抑制转录因子[38]：LncRNA与转录因子相互作用，干扰转录因子与DNA结合的结构域，抑制转录因子与DNA的结合，从而抑制下游基因转录。③影响转录因子核内外穿梭[39]：LncRNA与转录因子相互作用，抑制其向核内穿梭，从而抑制转录因子下游基因转录。

3.4 对微小RNA和mRNA进行转录后调控

LncRNA竞争性结合微小RNA(miRNA)，抑制miRNA与目标mRNA结合，称作LncRNA诱导的miRNA沉默，此LncRNA被称为内源性竞争RNA(ceRNA)，又被称为“miRNA海绵”。LncRNA可与特定mRNA的5’端特定区域结合，促进mRNA与翻译因子结合，从而促进mRNA翻译。LncRNA也可结合于特定mRNA的3’端特定区域，降低mRNA稳定性并促进mRNA降解，抑制mRNA功能[40]。

图3 LncRNA作用机制

4 LncRNA与软骨分化

目前对于信号通路、转录因子和miRNA在MSC向软骨分化及软骨ECM生成中所起作用的研究相对较多[41-42]，而LncRNA在其中的作用也开始逐渐受到关注。

如今在胚胎组织成软骨中同源异形盒(HOX)基因相关LncRNA作用受到的关注日益增多。其中，LncRNA-HIT在未分化的四肢MSC中表达，定位于核内，募集核因子-κB p100亚基(p100)/环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(CBP)复合体，并启动成软骨分化。通过小干扰RNA(siRNA)沉默LncRNA-HIT，使MSC聚集并显著降低成软骨能力。这表明LncRNA-HIT在四肢成软骨过程中发挥着无法取代的重要作用[11]。

在成体多能干细胞成软骨研究中，LncRNA的作用也被初步揭示。性别决定区Y框蛋白4(SOX4)在滑膜间充质干细胞(SMSC)的增殖和软骨分化中发挥重要作用，但其作用机制尚未明确。Zhang等[43]研究发现，SOX4通过激活LncRNA-DANCR发挥功能，若阻断LncRNA-DANCR，SOX4则失去促SMSC增殖和成软骨的功能。

通过高通量检测，结合生物信息学分析，对不同组织、不同发育阶段、不同生理或病理条件、疾病发展不同阶段的转录组数据进行统计分析，可得到差异表达基因、基因功能归类注释、基因相互作用网络、代谢及信号通路等结果，从而预测基因功能。对LncRNA的功能预测可进一步通过靶基因预测、未知LncRNA预测、LncRNA与mRNA高通量检测结果整合并行共表达网络分析实现。

有研究[44]报道，经基因芯片检测发现，在成软骨分化过程中有2 166个LncRNA显著上调，1 472个LncRNA显著下调；对其中ZBED3-AS1和LINC01589进行共表达网络分析和靶点预测，结果显示这2个LncRNA与成软骨中起重要作用的mRNA密切相关。此高通量研究筛选出在软骨分化过程中可能发挥功能的候选LncRNA，但需进一步研究验证并深入探讨作用机制。

5 LncRNA与OA

在OA进程中，生长因子、细胞因子、趋化因子、炎症、氧化应激和代谢相关研究已较为详尽[45]，但目前仍未找到能够延缓OA进展的有效方法。近来有研究发现，LncRNA的表观遗传修饰在OA中发挥重要作用，例如LincRNA-UFC1通过充当“miRNA海绵”，沉默miR-34a，阻断其对软骨增殖的抑制作用。表观遗传修饰改变在OA进展中发挥着至关重要的作用，但仅仅是通过细胞因子和简单的对症治疗难以逆转OA进展。而LncRNA可通过甲基化或乙酰化对组蛋白进行修饰，调节基因转录活性[22,46-47]。因此，利用LncRNA的表观遗传干预能力，有望研制出靶向治疗药物。

5.1 参与软骨破坏

研究显示，HOX基因相关LncRNA在OA发生发展中起到了重要的作用。HOTAIR在白细胞介素(IL)-1β诱导的OA细胞模型中明显上调，而敲低HOTAIR可抑制由IL-1β诱导的基质金属蛋白酶(MMP)-1、MMP-3、MMP-9生成，同时能明显降低IL-1β导致的细胞凋亡[12]。HOTAIR可能是连接炎性因子与软骨破坏之间的桥梁，以HOTAIR为靶点，有希望获得针对软骨的抗炎药，取代普遍使用、有较多不良反应的糖皮质激素。在OA进展中HOTTIP明显上调，它可抑制整合素α1的表达，破坏软骨细胞与ECM间的连接，导致软骨破坏[13]。在OA软骨中GAS5明显上调，GAS5可抑制miRNA-21而促进MMP(包括MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-13)和含血小板反应蛋白基序的金属蛋白酶系统(ADAMTS)-4表达，促进细胞凋亡，同时抑制自噬反应[14]。LncRNA-CIR通过促进MMP-13和ADAMTS-5表达参与软骨ECM降解[15]。机械应力也是加速OA进程的因素，它可导致LncRNA-MSR上调，并破坏软骨[16]。机械应力对软骨的刺激始终存在，且可持续造成软骨破坏。

5.2 保护软骨

H19在成熟的关节软骨细胞中受SOX9调控。H19及其衍生的miRNA-675可促进Ⅱ型胶原分泌，并维持软骨细胞稳定[17]。研究[48]发现，低氧环境能保护关节软骨，其中低氧诱导因子(HIF)-1α可通过与β-连环蛋白相互作用保护软骨细胞。近期研究[49]发现，H19衍生的miRNA-675可促进HIF-1α表达，抑制HIF-1α在有氧情况下的降解，高水平HIF-1α可起保护软骨的作用。H19不仅能阻止软骨破坏，还能促进软骨ECM分泌，具有保护和修复双重作用，拥有重要的研究价值和广阔的应用前景。LincRNA-UFC1具有促进软骨细胞增殖和抑制软骨细胞凋亡的作用，在OA软骨中的表达量明显减低[22]。通过核酸纳米递送系统[50-51]将Linc-UFC1递送至OA软骨，有望延缓OA进程。

5.3 其他作用

PACER、CILinc01和CILinc02在IL-1β刺激后发生显著改变，可能参与了软骨细胞炎症反应[18]，但它们在OA病程中发挥的具体功能还有待后续研究深入探讨。与血管新生相关的LncRNA-MEG3在OA软骨中的表达量明显下降[19]，但其在OA病程中的功能还未明确，有待深入研究。

5.4 芯片预测

近年有学者通过基因芯片检测发现OA软骨中有121个LncRNA发生显著改变，通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测到其中6个上调的LncRNA(HOTAIR、GAS5、PMS2L2、KCNK15-AS1、H19和ENSG00000260114)[52]。目前尚缺乏PMS2L2、KCNK15-AS1和ENSG00000260114与软骨或OA的相关研究。

6 展望

ncRNA的发现改变了学者们对转录组的认识，miRNA研究日趋完善，但仅仅通过mRNA和miRNA尚不足以解释生长发育和疾病发生中的各种现象。而LncRNA通过与mRNA、miRNA、DNA和蛋白的相互作用，实现表观遗传调控，成为了近年研究热点。但LncRNA在OA中的作用仍存在许多亟待解决的问题有待深入研究：①基因芯片研究发现多种LncRNA在软骨分化中发生显著改变，但哪些LncRNA发挥主要作用，以及其作用机制如何，目前仍未阐明；②OA发病过程中哪些表达有显著差异的LncRNA在软骨破坏中发挥重要作用及其具体作用机制，尚未明确；③在软骨分化和OA进展中，可以针对哪些LncRNA进行干预，达到促进软骨修复的目的。

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(收稿：2016-08-22; 修回：2016-10-07)

(本文编辑：卢千语)

国家自然科学基金面上项目(81572239、81472066)、国家自然科学基金青年基金(81301589)

200233， 上海交通大学附属第六人民医院骨科(陶诗聪、张长青)、上海交通大学附属第六人民医院四肢显微外科研究所(郭尚春、张长青)；200025， 上海交通大学医学院(陶诗聪)

张长青 E-mail: zhangcq@sjtu.edu.cn

10.3969/j.issn.1673-7083.2016.06.009