阿帕替尼对三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞抑制作用体外研究*

陕西省肿瘤医院内一科(西安 710061)李 旭 安改丽 黄尚科 郑 琪 张 茜 廖子君 赵新汉#



阿帕替尼对三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞抑制作用体外研究*

陕西省肿瘤医院内一科(西安 710061)李 旭 安改丽△黄尚科▲郑 琪 张 茜 廖子君 赵新汉▲#

目的:探讨阿帕替尼对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231生长影响及其机制。方法：将不同浓度的阿帕替尼作用乳腺癌MDA-MB-231细胞24h、48h、72h，采用MTT法检测不同浓度及时间的阿帕替尼对MDA-MB-231细胞的生长抑制作用；采用流式细胞仪检测阿帕替尼对MDA-MB-231细胞作用后的凋亡率及其细胞周期分布的影响。结果：阿帕替尼对乳腺癌MDA-MB-231细胞有明显的生长抑制作用，且存在时间剂量依赖关系；阿帕替尼可以明显的促进细胞凋亡, 其凋亡率随时间延长而显著增加, 与对照组相比, 差异具有统计学意义；阿帕替尼对MDA-MB-231细胞的作用与其对细胞周期的相关性作用不明显。结论 阿帕替尼能通过诱导细胞凋亡抑制三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖能力。

新生血管为肿瘤的生长和发展提供了必要的条件,肿瘤血管生成和肿瘤发生和发展的密切关系，所以肿瘤血管成为抗肿瘤治疗的重要靶点之一，这在多种恶性肿瘤的治疗中得到了验证和应用[1]。近年来乳腺癌抗血管生成治疗再次引起了人们的广泛关注[2-3]。甲磺酸阿帕替尼片是一种口服的小分子抗血管生成新药，通过抑制肿瘤血管生成来发挥抗肿瘤的作用，目前临床发现其对多种肿瘤有抗肿瘤作用。不仅可以抑制肿瘤新生血管, 还能直接抑制肿瘤细胞的生长发挥抗肿瘤作用[4]。三阴性乳腺癌是一种特殊类型的乳腺癌亚型，不能从内分泌治疗和抗Her-2治疗中获益，是目前临床研究的热点和难点，作为三阴性乳腺癌代表的MDA-MB-231细胞系被发现与血管生成较为密切。因此，本研究旨在探讨阿帕替尼对三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞生长的影响及可能机制，为阿帕替尼应用于三阴性乳腺癌患者的治疗提供实验基础。

材料与方法

1 材 料 人乳腺癌MDA-MB-231细胞株(中科院上海细胞库)；RPMI 1640培养基(美国GIBCO公司)；噻唑兰(MTT)(美国sigma公司)；二甲基亚砜(DMSO)(美国sigma公司)；Annexin-V/PI双染凋亡试剂盒(江苏凯基)；DNA含量检测试剂盒(细胞周期)(江苏凯基)；细胞培养箱( 美国Thermo 公司)；Genios 多功能酶标仪( 美国TECAN 公司)； FACScan 流式细胞仪( 美国BD 公司)； Odyssey 双色红外荧光成像系统扫描仪(美国LI-COR 公司产品)；倒置显微镜( DXM1200) (日本Nikon 公司)。

2 方 法

2.1 细胞培养：对三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞采用含10%小牛血清的RMPI-1640进行培养基，于37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱内培养，待其贴壁生长至70%～80%时，用0.25%胰蛋白酶消化传代。取对数生长期的细胞实验。

2.2 细胞增殖抑制率检测：取对数生长期的乳腺癌MDA-MB-231细胞以约1×104/ml密度接种于96孔板上，将5、10、20、40、80 g/ml浓度的阿帕替尼分别加入孔内，每孔加200l，每组5个复孔。以含相同浓度的DMSO培养液为对照，培养24h、48h、72h后每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)20 L，孵育4 h，终止培养，吸去培养上清液，每孔加入150 L DMSO，振荡10 min，充分溶解结晶物。用多功能微板测试系统于490 nm处测定OD值。实验重复3次。抑制率(%)=(1-试验孔平均OD 值/对照孔平均OD值)×100%，绘制生长抑制曲线。

2.3 流式细胞仪检测细胞周期和凋亡：取对数生长期的MDA-MB-231细胞消化后将细胞浓度控制在1×106个/ml，以2ml/孔接种于6孔板内，RPMI-1640培养基孵育48h 后，用阿帕替尼(20mg/ml)处理24h 、48h 、72h后, 收集各处理组MDA-MB-231细胞。细胞周期检测将收集的细胞用PBS 洗涤二次后以70 %乙醇4 ℃固定过夜, 加入RNA 酶至终浓度为100 mg/ml , 加入PI 至终浓度50 mg/ml , 37 ℃避光染色30 min,流式细胞仪检测。凋亡检测采用不含EDTA的胰酶消化收集后，用PBS洗涤细胞2次，加入500ml的Bingding Buffer悬浮细胞，加入5ml Annexin-V/PI混匀后，加入5ml PI，混匀后室温避光反应15min后在1h内进行流失细胞仪的检测。本实验重复3次。

3 统计学方法 采用SPSS 18.0 统计学软件进行独立样本t检验及多个样本均数比较的方差分析， 以P<0 .05为差异有统计学意义。

结 果

1 MTT 不同浓度梯度的阿帕替尼作用于三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞24 -72 h 后, 其生长抑制率，见表1。绘制生长抑制曲线，见图1。多个样本均数比较的方差分析显示,阿帕替尼24h组与阿帕替尼作用72h组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。阿帕替尼对MDA-MB-231细胞体外生长具有明显的增殖抑制作用, 随浓度的增加, 抑制率明显升高, 呈现明显的时间-剂量依赖关系 (P<0 .05)。

表1 阿帕替尼作用MDA-MB-231细胞不同时间的生长抑制率

图1 阿帕替尼对乳腺癌MDA-MB-231细胞生长抑制

2 流式细胞仪测定细胞凋亡及细胞周期 MDA-MB-231细胞经20mg/ml的阿帕替尼分别处理24h、48h、72h后, 与空白对照组一起上流式仪检测凋亡情况。结果对照组、阿帕替尼24h、48h、72h组凋亡率均值分别为0.46 %、5.32 %、9.17 %、13.83 %,对照组与各干预组，以及各干预组间比较差异均具有统计学意义(P<0.05),提示阿帕替尼处理后各组细胞凋亡率均显著增加, 呈时间依赖关系(图2、图3)。阿帕替尼20mg/ml作用MDA-MB-231细胞48h，与空白对照比较细胞周期，处理组G0/G1、G2/M、S期均值比例分别为63.15%、31.76%、5.09%；对照组分别为62.64%、32.89%、4.47%，处理组对细胞周期无明显影响，同对照组比较无明显统计学差异(P>0.05)。

讨 论

乳腺癌是一类异质性很高的恶性肿瘤，基于分子表型可分为4种亚型：Luminal A 型、Luminal B 型、Her-2过表达型和基底样型[5]。四种不同分子亚型的乳腺癌患者具有不能的临床病理特征及不同的预后，治疗方面也存在一定的差异[6]。 三阴性乳腺癌(TNBC)是ER、PR、Her-2受体均阴性的乳腺癌，是具有独特生物学特性及临床特征的一种乳腺癌亚型,有将近10%～20.8%的乳腺癌患者属于此种类型[7]。由于其不能从内分泌治疗及靶向Her-2治疗中获益，导致三阴性乳腺癌患者预后差、复发转移率高、病死率高。

图2 阿帕替尼对乳腺癌MDA-MB-231细胞不同作用时间点流式凋亡

图3 阿帕替尼对乳腺癌MDA-MB-231细胞不同作用时间流式凋亡率比较

随着科学家对恶性肿瘤认识的不断加深，肿瘤抗血管生成已经成为当今肿瘤研究的热点及治疗新策略。甲磺酸阿帕替尼片是一种小分子抗血管生成的口服抑制剂，通过高度选择性地抑制血管内皮生长因子受体-2( VEGFR-2) 酪氨酸激酶的活性，阻断血管内皮生长因子( VEGF) 与其受体结合后的信号转导通路，从而抑制肿瘤血管生成，实现抗肿瘤作用[8]。2014年12月国家食品药品管理监督总局( CFDA)批准其为晚期胃癌或胃食管结合部腺癌三线及三线以上治疗方案。

本研究用不同浓度的阿帕替尼作用MDA-MB-231细胞24～72 h 后, 采用MTT 法检测不同浓度实验组的细胞生长抑制率, 结果表明MDA-MB-231细胞的生长受到明显抑制,抑制率随阿帕替尼浓度和作用时间的增加而增加, 呈一定的时间-剂量依赖关系。可见阿帕替尼对MDA-MB-231细胞的生长抑制作用可能还通过诱导肿瘤细胞的凋亡发挥直接抗肿瘤作用[4]。本实验观察阿帕替尼作用MDA-MB-231细胞的凋亡情况，证实阿帕替尼可以诱导MDA-MB-231细胞的凋亡,凋亡率随给药时间的递增而增强。是否也参与对MDA-MB-231细胞血管生成的作用还有待进一步研究。总之，阿帕替尼对三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞具有生长抑制作用，且存在时间-剂量依赖关系；阿帕替尼可以诱导细胞凋亡，其对乳腺癌MDA-MB-231的抑制作用机制与其促进乳腺癌细胞凋亡有关。

阿帕替尼作为新型的口服小分子抗血管生成抑制剂新药，以其毒性低,疗效确切的特点在肿瘤治疗中备受瞩目。其不仅通过抑制肿瘤新生血管起到抗肿瘤作用，我们的研究证实其也能通过直接抑制肿瘤细胞的生长、诱导肿瘤细胞凋亡发挥抗肿瘤作用。本研究为阿帕替尼和其他肿瘤治疗方式的结合, 提高肿瘤综合治疗疗效提供了一定的实验基础,我们还将研究其与其他化疗药物联合应用的抗肿瘤作用机制，为以后其临床应用提供更充分的实验依据。

[1] 王志东，杨 军，李宗芳.肿瘤抗血管生成靶向治疗[J].中国实用外科杂志, 2010,30(7):613-615.

[2] 朱鹏晋，邹立群.三阴乳腺癌抗血管生成治疗进展及影像学评价[J].华西医学，2015, 30(8):1587-1592.

[3] Luo M, Hou L, Li J,etal.VEGF/NRP-1axis promotes progression of breast cancer via enhancement of epithelial-mesenchymal transition and activation of NF-κB and β-catenin[J].Cancer Lett,2016,(16):22-27.

[4] Scott AJ, Messersmith WA, Jimeno A,etal.Apatinib: A promising oral antiangiogenic agent in the treatment of multiple solid tumors[J].Drugs Today (Barc),2015,51(4):223-229.

[5] 张改华,杜文英. 乳腺癌151例分子亚型临床与病理特点[J]. 陕西医学杂志,2014,43(7):909-911.

[6] 陆春燕,吕凤菊,陈浩华,等. 浸润性乳腺癌分子亚型患者的临床特征及预后研究[J]. 实用医学杂志,2012,5:765-767.

[7] 韩颜泽, 赵金鹏, 孙岩岩.三阴型乳腺癌的化学治疗和靶向治疗进展[J].现代生物医学进展，2014, 14(22):4397-4400.

[8] Hu X, Zhang J, Xu B,etal.Multicenter phase II study of apatinib, a novel VEGFR inhibitor in heavily pretreated patients with metastatic triple-negative breast cancer [J].Int J Cancer,2014,135(8):1961-1969.

(收稿：2016-02-23)

The inhibitory effect of Apatinib on the growth of triple negative breast cancer cell line MDA-MB-231 in vitro Department of First Internal Medicine, Shaanxi Province Tumor Hospital(Xi’an 710061)

Li Xu An Gaili Huang Shangke et al

Objective: To investigate the effect of Apatinib on the proliferation of triple negative breast cancer cell line MDA-MB-231 cells as well as the relevant underlying mechanism. Methods:MDA-MB-231 cells were treated with Apatinib at different concentration and different time, Cell growth inhibition was assessed by MTT, the apoptosis and cell cycle changes of the cells in response to apatinib treatment were observed by flow cytometry. Results:Apatinib significantly inhibited the proliferation of MDA-MB-231 cells in vitro, and the inhibition effects presented with time-and dose-dependent response. Apatinib treatment obviously increased the apoptotic rate of the MDA-MB-231cellsina time-dependent manner, and the difference has statistical significance compared with the control group; but produced no significant effect on the cell cycle. Conclusion: Apatinib inhibited the proliferation of MDA-MB-231 cells through inducing cell apoptosis.

Breast neoplasms/immunology Angiogenesis inhibitors MDA-MB-231 Cell proliferation Apoptosis

*陕西省自然科学基金资助项目(2015JM8394)

乳腺肿瘤/免疫学 血管生成抑制剂/治疗应用 MDA-MB-231 细胞增殖 细胞凋亡

R392.5

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2016.11.002

陕西省卫生和计划生育委员会科研项目(2014D15)

△陕西省人民医院

▲西安交通大学第一附属医院肿瘤内科

#通讯作者