自组装多肽的合成，多肽自组装成纳米纤维凝胶及其与珊瑚，BMP-2组成复合材料——结构观察与展望

陈辰 厦门大学附属第一医院骨科 （福建 厦门 361003）

自组装多肽的合成，多肽自组装成纳米纤维凝胶及其与珊瑚，BMP-2组成复合材料
——结构观察与展望

陈辰 厦门大学附属第一医院骨科 （福建 厦门 361003）

目的：合成含有连接蛋白核心序列Link N的多肽两亲性分子RADA16，研究其自组装形成凝胶支架的超微结构。将RADA16，珊瑚和BMP-2组成复合材料体系，研究其超微结构。方法：将RADA16溶解于10%无菌蔗糖溶液中，浓度为1%（10mg/ml，m/v），将RADA16用等体积细胞培养基DMEM/F12溶液触发多肽自组装，扫描电镜。将RADA16与BMP-2溶液等比例混合（1:1），再将其浸没珊瑚，并用等体积细胞培养基DMEM/F12溶液触发多肽自组装，扫描电镜检测。结果：成功合成RADA16多肽两亲性分子，多肽溶液RADA16混合自组装形成凝胶。原子力显微镜检测显示：RADA16自组装形成纳米纤维，直径大于31.9士3.8 nm，长度可达到几微米。扫描电镜显示：RADA16自组装形成片层与网状结构。RADA16附着于珊瑚孔隙中，BMP-2粘附于多肽上，成功合成复合材料体系（自组装多肽，珊瑚，BMP-2）。结论：多肽RADA16在特定的条件下可以自组装形成纳米级凝胶支架（RADARADARADARADARADA），复合材料体系（自组装多肽，珊瑚，BMP-2）可以作为骨折修复组织工程的生物支架材料。

珊瑚 多肽 BMP-2 自组装 纳米纤维 凝胶 支架

骨折是骨科创伤常见病，是引起肢体残疾最常见的原因之一，目前的治疗手段，如复位外固定，切开复位内固定等虽然可以完成骨折的复位和固定，但有可能破坏骨折周围的软组织环境和血供，可能导致骨折的延迟愈合甚至不愈合[1～2]。

生物医学领域中，组织工程是一个快速发展的新方向。

骨组织工程可以为骨组织修复提供环境和材料，因而为骨折治疗提供了新的手段。最近的研究表明，细胞&材料复合体的结构，如机械强度、超微结构等，越接近目标组织的结构越有利于细胞生物功能的执行。与传统生物材料相比，复合材料体系具有下列优点：①全部由生物性成分组成，生物相容性好，无明显毒性，易代谢，无明显排异反应；②复合结构与目标组织结构相近；③含水量高，营养物质易于运输，代谢废物易于排出；④制备简单、可进行功能再设计，结构可接受更多的材料组合；⑤复合材料体系单个单位体积较小，适于微创手术操作[3]。

本实验拟在前期研究的基础上，研究复合材料体系（自组装多肽/珊瑚/BMP-2）在体外的对种子细胞BMSCs的生物学行为的影响，以期为骨组织工程打开新的思路。

1.材料与方法

（1）多肽分子的合成

RADA16：ACN-RADARADARADARADA-CONH2o

（2）多肽的溶解

将90ml去离子水与10g蔗糖混合，待蔗糖完全溶解。将其分装与两个50ml离心管中。将10mg自组装多肽粉末与1ml蔗糖溶液混合于2ml微型管中。在37°C恒温下，悬浮超声自组装多肽溶液30min。

（3）多肽的自组装

将经过超声处理的多肽溶液500ul至于2ml新的微型管中。将两个微型管放置于温箱中，37°C孵育30min取出微型管，倒置并观察多肽自组装的情况。按1:1的比例向两个微型管中各加入500ul的DMEM/F12培养基，用200ul吸量管枪头轻轻吹打，使多肽溶液和DMEM/F12培养基充分混合。多肽溶液终浓度为0.5%。将两个微型管再次放入温箱中，37°C恒温孵育2～3h。取出微型管，再次观察自组装多肽的成胶情况，并取少量自组装多肽溶液置于载玻片上，可选择加入0.lmol/L CaCl2溶液促进自组装，观察多肽自组装的情况。

（4）珊瑚微结构的观察

将珊瑚用手锯，切割成5×5×5mm的立方体，超声去除孔隙中的杂质，高压蒸汽灭菌后，样本镀金处理，通过扫描电镜（冷场）检测，放大倍数控制在50～100倍。用Topomatrix图像分析软件对检测结果进行分析。

（5）自组装多肽凝胶支架超微结构观察

将之前制备完成的RADA16溶液再次超声处理20min，加入相同体积的DMEM/F12细胞培养基，其目的是触发多肽的自组装。使用冷冻真空干燥法干燥6h或梯度乙醇脱水法，使其外观呈黏样粉末状。样本镀金处理后，通过扫描电镜（冷场）检测，放大倍数控制在7500～10000倍。用Topomatrix图像分析软件对检测结果进行分析。

（6）复合材料体系超微结构观察

将RADA16与BMP-2溶液等比例混合（1:1），再将其浸没珊瑚，加入相同体积的DMEM/F12细胞培养基，其目的是触发多肽的自组装。使用冷冻真空干燥法干燥6h或梯度乙醇脱水法。样本镀金处理后，通过扫描电镜（冷场）检测，放大倍数控制在7500～10000倍。用Topomatrix图像分析软件对检测结果进行分析。

（7）统计学处理

进行数据分析（SPSS 11.0统计软件），数据使用均数土标准差（x±S）表示，复合材料体系（实验组），RADA16+BMP-2（对照组1）和珊瑚+BMP-2（对照组2）之间的比较采用标准t检验，α=0.05为检验标准。

2.结果

（1）多肽分子合成

成功合成了多肽分子RADA16

使用用高效液相色谱仪（HPLC）和质谱仪（MS）进行纯化和分析。

多肽分子RADA16的分子量为1712.79Da，纯度为95.12%。

（2）多肽自组装形成凝胶多肽

RADA16溶解后形成无色透明水凝胶，微形管倒置30min后凝胶仍紧密黏附于管底，无滑脱；为了进一步观察多肽自组装的情况，我们将RADA16多肽溶液置于载玻片上，用CaCl2溶液促进其自组装。RADA16多肽溶液在CaCl2溶液触发下形成无色粘弹性凝胶。

图1. CaCl2溶液触发RADA16多肽溶液形成自组装多肽凝胶。

图2. 100倍珊瑚扫描电镜下观。

图3. 10000倍RADA16自组装多肽凝胶扫描电镜下观，纳米纤维及片层样规则结构形成。

图4. 10000倍扫描电镜下观，骨形态发生蛋白BMP-2均匀附着于RADA16自组装多肽凝胶上。

（3）珊瑚微结构的观察

珊瑚于电镜下呈多孔状结构，孔隙排布紧密，大小均匀，孔隙大小从200um到500um不等。

（4）自组装多肽凝胶超微结构观察

为使得自组装多肽不至在高温下变性融化，我们选用冷场扫面电镜观察自组装多肽凝胶的超微结构。冷场扫描电镜真空室内温度接近室温，与热场扫描电镜真空室500°C左右的高温相比，更适用于生物材料的检测。扫描电镜图像显示：多肽RADA16自组装形成纳米纤维及片层堆叠结构（RADA16，凝胶纤维直径D=13.2±1.6nm）。其长度从几百纳米到几微米不等。

（5）复合材料体系超微结构观察

为使得自组装多肽及BMP-2不至在高温下变形融化及失活，我们选用冷场扫面电镜观察自组装多肽凝胶的超微结构。冷场扫描电镜真空室内温度接近室温，与热场扫描电镜真空室500°C左右的高温相比，更适用于生物材料的检测。扫描电镜图像显示：自组装多肽的纳米结构分布于珊瑚的空隙中，而在自组装多肽的纳米架构上，均匀黏附着骨形态发生蛋白颗粒。由此，珊瑚，自组装多肽，骨形态发生蛋白三者形成了层层递进的超微复合材料体系。

3.讨论

在兼顾了骨折传统治疗的基础上，组织工程，特别是骨组织工程为骨折的治疗开辟了一个崭新的前景。正如之前所提到的，对于组织工程而言，主要包括如下基本元素：生物材料，种子细胞和调控因子。这三者组合在一起，能在体外模拟组织再生的条件，从而达到修复组织损伤与退变的目的。

通过组织工程学的原理来修复创伤，特别是骨折，已成为目前学界的研究热点。而组织工程三要素中，构建具有良好结构和生物学活性的支架材料，却一直是组织工程的难点之一。在以往的研究中，被用于骨组织重建再生的材料有很多，如藻酸盐、壳聚糖等。这些材料虽然能呈现出一定的，促进细胞黏附，增殖和细胞分化的性能。但相对与人天然骨组织的性能而言，还远远不够。故构建出具有优良生物学活性，同时能提供合适的微环境给种子细胞增殖分化的生物材料就成了目前的主要研究方向[4～5]。

自组装多肽纳米纤维凝胶的自组装机理如下：肽是由氨基酸经由酰胺键连接的短的低聚物。氨基酸是组成蛋白质和肽天然积木结构[6]。氨基酸包括胺，羧酸和官能团以及独特的侧链。共计大约20种不同的氨基酸，以及20种不同的侧链，这些赋予了其独特的性质和可变性。存在于氨基酸侧链的差异使它们能够按照它们的化学组合被分成不同的类别，例如疏水性/亲水/脂族/芳族或中性/正/负电荷。氨基酸之间的众多相互作用也使得其能发展出复杂的自组装纳米结构。这些类型的相互作用包括氢键，静电相互作用，疏水相互作用，芳族相互作用（π-π堆叠）和范德华力[7]。人们利用氨基酸变化的特性操纵肽的自组装，以此来设计新的功能性生物材料。即自组装多肽纳米纤维凝胶[8～9]。自组装多肽纳米纤维凝胶不仅具备原来多肽分子的生物性能，由于其规则排列形成的三维超微结构，使得其还具有更接近于天然结构的材料性能[10]。

珊瑚作为一种天然材料，主要成分为羟基磷灰石，其成分与骨组织的刚性成分较为相似，而其孔隙结构具有较高的孔隙率，无论对活性成分或是种子细胞都有很好的容

纳性质。珊瑚已在口腔科和颌面部修复方面有着广泛的应用，而在此系统中，珊瑚作为整体结构中的刚性成分，保证了整个系统的强度，同时对骨折两侧短端的连接作用也有助于骨折的修复。RADA16（PuraMatrix）是一种由（R，精氨酸）和（A，天门冬氨酸）这两种阳性和阴性氨基酸分别交替组成的自组装多肽。RADA16多肽可以在适宜条件下自发的发生分子间自组装形成有序三维纤维凝胶支架[11～12]。其已被广泛应用于药物缓释，细胞三维培养及组织再生。RADA16作为整体结构中的柔性成分，其作用主要在于在珊瑚刚性结构的保护下，在其孔隙中形成自发的三维结构，一方面增加了珊瑚孔隙的表面积，另一方面其生物活性特性有助于提供种子细胞更适宜的生长微环境。研究表明，BMP-2在调节因子方面，骨形态发生蛋白无疑是最理想的选择之一。其能够在人体内诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，也在体外实验中被证实。研究发现，符合了骨形态发生蛋白的骨移植，其效果，好于单纯的骨移植治疗。所以其在系统中，承担下了微环境中生长因子的重要职能[13]。

复合材料体系（自组装多肽/珊瑚/BMP-2）具有以下优点：①全部由氨基酸，天然材料和成分组成，生物相容性好，无明显毒性，易代谢，无明显排异反应；②珊瑚的孔隙结构与自组装多肽形成的三维结构与骨组织结构相近；③珊瑚孔隙率高，自组装多肽凝胶含水量高，达95%以上，营养物质易于运输，代谢废物易于排出；④制备简单、自组装多肽可进行功能再设计，而珊瑚结构可接受更多的材料组合；⑤复合材料体系单个单位体积较小，适于微创手术操作。此外，这种复合材料体系（自组装多肽/珊瑚/ BMP-2）的机械强度接近于正常骨组织，为骨组织工程提供了新的思路[14～15]。

[1] Tcacencu I, Karlström E, Cedervall J, et al., Transplanted Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Seeded onto Peptide Hydrogel Decrease Alveolar Bone Loss[J]. Biores Open Access, 2012,1(5):215-221.

[2] Chen K, Shi P, Teh TK, et al., In vitro generation of a multilayered osteochondral construct with an osteochondral interface using rabbit bone marrow stromal cells and a silk peptide-based scaffold[J]. J Tissue Eng Regen Med, 2016 Apr；10(4):284-293.

[3] Chung EJ, Chien KB, Aguado BA, et al., Osteogenic potential of BMP-2-releasing self-assembled membranes[J]. Tissue Eng Part A, 2013,19(23-24):2664-2673.

[4] Childs A, Hemraz UD, Castro NJ, et al., Novel biologically-inspired rosette nanotube PLLA scaffolds for improving human mesenchymal stem cell chondrogenic differentiation[J]. Biomed Mater, 2013,Dec；8(6):065003.

[5] Miller RE, Grodzinsky AJ, Barrett MF, et al., Effects of the combination of microfracture and self-assembling Peptide filling on the repair of a clinically relevant trochlear defect in an equine model[J]. J Bone Joint Surg Am, 2014,96(19):1601-1609.

[6] Ikeno M, Hibi H, Kinoshita K, et al., Effects of self-assembling peptide hydrogel scaffold on bone regeneration with recombinant human bone morphogenetic protein-2[J]. Int J Oral Maxillofac Implants, 2013,28(5):283-289.

[7] Kaltofen S, Li C, Huang PS, et al., Computational de novo design of a self-assembling peptide with predefined structure[J]. J Mol Biol, 2015,427(2):550-562.

[8] Wang B, Sun C, Shao Z, et al., Designer self-assembling Peptide nanofiber scaffolds containing link protein N-terminal peptide induce chondrogenesis of rabbit bone marrow stem cells[J]. Biomed Res Int, 2014；2014:421954.

[9] Dissanayaka WL, Hargreaves KM, Jin L, et al., The interplay of dental pulp stem cells and endothelial cells in an injectable Peptide hydrogel on angiogenesis and pulp regeneration in vivo[J]. Tissue Eng Part A, 2015,21(3-4):550-563.

[10] Fernández-Muiños T, Recha-Sancho L, López-Chicón P, et al., Bimolecular based heparin and self-assembling hydrogel for tissue engineering applications[J]. Acta Biomater, 2015 Apr；16:35-48.

[11] Zweckberger K, Liu Y, Wang J, et al., Synergetic Use of Neural Precursor Cells and Self-assembling Peptides in Experimental Cervical Spinal Cord Injury[J]. J Vis Exp, 2015 Feb 23；(96):e52105.

[12] Kumar VA, Taylor NL, Shi S, et al., Highly angiogenic Peptide nanofibers[J]. ACS Nano, 2015.9(1):860-868.

[13] Liu Y, Ye H, Satkunendrarajah K, et al., A self-assembling peptide reduces glial scarring, attenuates post-traumatic inflammation and promotes neurological recovery following spinal cord injury[J]. Acta Biomater, 2013,9(9):8075-8088.

[14] Rey-Rico A, Venkatesan JK, Frisch J, et al., Effective and durable genetic modification of human mesenchymal stem cells via controlled release of rAAV vectors from self-assembling peptide hydrogels with a maintained differentiation potency[J]. Acta Biomater, 2015 May；18:118-27.

[15] Kopesky PW, Lee HY, Vanderploeg EJ, et al., Adult equine bone marrow stromal cells produce a cartilage-like ECM mechanically superior to animal-matched adult chondrocytes[J]. Matrix Biol, 2010,29(5):427-438.

Biosynthesis of Self-assembling Peptide, Peptide Self-assembling and Construction of Material System of Self-assembling Peptide, Natural Coral and BMP-2

CHEN Chen Dept of Orthopaedics, the first Affiliated Hospital of Xiamen University (Fujian Xiamen 361003)

Objective: To synthesize the self-assembling peptide RADA16 and investigate its microstructure. construct a material system of self-assembling peptide, natural coral and BMP-2 and investigate its microstructure. Methods: The RADA16 peptides was dissolved in 10% sterile sucrose at a final concentration of 1% (l0mg/ ml, m/v). Peptides solution is treated with equal volume of Dulbecco's, Modified Eagle Medium F-12(DMEM-F12) solutions. The microstructures of peptide scaffolds were observed using scanning electron microscopy (SEM). The RADA16 peptides solution and BMP-2 solution were put together with equal volume. Then the combined solution is put to merge the nature coral. The microstructures of the system is observed using scanning electron microscopy (SEM). Results: The RADA16 peptide is successfully synthesized. The SEM images demonstrated that the nanofibers was observed in RADA 16 peptide sample, and the length of these fibers could be ranging from several hundreds nanometers to a few microns. The material system of self-assembling peptide, natural coral and BMP-2 is successfully synthesized. The SEM images demonstrated that the structure of the system is with ruled and systemic layers and levels. Conclusions: The RADA16 scaffold and the material syetem of RADA16, natural coral and BMP-2 can be sussessfully made, which could be useful in the bone regeneration.

coral, BMP-2, peptide, self-assembly, nanofiber, hydrogel, scaffold

1006-6586(2016)06-0015-04

R318.08

A