尼罗罗非鱼不同品系间mtDNA D-loop差异分析

肖 炜，李大宇，邹芝英，祝璟琳，韩 珏，杨 弘

(中国水产科学研究院淡水渔业研究中心/农业部淡水鱼类遗传育种和养殖生物学重点开放实验室, 江苏 无锡 214081)



尼罗罗非鱼不同品系间mtDNA D-loop差异分析

肖 炜，李大宇，邹芝英，祝璟琳，韩 珏，杨 弘*

(中国水产科学研究院淡水渔业研究中心/农业部淡水鱼类遗传育种和养殖生物学重点开放实验室, 江苏 无锡 214081)

通过PCR扩增获得尼罗罗非鱼“88品系”(XH)、“99品系”(AN)和吉富品系(GF)3个主要养殖品系共95尾鱼的mtDNA D-loop序列，并进行碱基测序及对比分析，探究3个品系在遗传结构信息、保种现状和选育潜力的差异。 结果表明:①3个品系个体序列片段长度为550～556 bp，包括111个变异位点，其中转换、颠换、插入/缺失数依次为65、34、12，多态位点比例为18.64 %。②3个品系共有27个单倍型，XH、AN、GF单倍型数依次为12、7、10，其中GF、AN共享1个单倍型，XH、GF共享1个单倍型，其他为各品系独有。3个品系的单倍型在NJ系统树上互相交叉，GF有2个单倍型在变异水平上形成独有的进化枝。③3个品系间遗传分化指数均大于0.05，存在中等程度的遗传分化，其中XH与AN、XH与GF之间遗传漂变起主要作用，AN与GF之间基因流起主要作用。研究结果表明，目前选育的3个尼罗罗非鱼品系内遗传多样性水平较高；品系间存在中等程度的遗传分化，并具备高比例的独有单倍型， 3个品系目前仍具备较高的选育潜力。

尼罗罗非鱼；养殖品系；遗传结构；mtDNA D-loop；遗传分化

尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)隶属于鲈形目(Perciformes)、丽鱼科(Cichlidae)罗非鱼属(Oreochromis)，是联合国粮农组织向全世界推广养殖的优质鱼类。20世纪80年代以来，我国数次引进尼罗罗非鱼原种群体，经过多代选育改良，形成数个性状优良的养殖品系，作为罗非鱼主要养殖品系在我国南方主产区得到推广，推动了我国罗非鱼种业稳步、快速的发展。罗非鱼不同品系群体间因为原种地生境隔离、人工选育方式差异等因素在生长特性和抗逆性方面也存在较大差异，同时在长期的选育过程中因为种间杂交、选育强度等因素易发生种质退化等现象[1]，因此了解目前罗非鱼主要养殖品系的种质情况对罗非鱼的保种选育及遗传多样性保护具有非常重要的意义。mtDNA D-loop是线粒体DNA中的一段非编码区，具有分子量小、结构简单、进化速度快、高度多态、母性遗传等特点，被广泛应用种群的进化研究和遗传多样性分析[2]。Beheregaray等[3]利用mtDNA D-loop结构分析了海洋与湖泊中的银汉鱼群(Odontesthesargentinensis)的遗传结构，发现两者有共同的祖先，因为生境变迁导致群体间出现明显的遗传分化；Ryota等[4]对利用mtDNA D-loop序列变异解析了日本北海道和本州的杜父鱼群(Cottusnozawae)的遗传结构，并探寻导致鱼群遗传分化的地理因素；Nakadate等[5]利用mtDNA D-loop序列分析对蓝鳍金枪鱼(Thunnusorientalis)开展个体繁殖力比较研究，寻找繁殖能力强的优异雌鱼；刘红艳等[6]对3个海南、福建、广东 3 地的野生黄鳍鲷(Sparuslatus)种群开展mtDNA D-loop序列分析对比，对 3 地种群亲缘关系进行了比较；张玉波等[7]利用mtDNA D-loop序列对东方鲀属11种鱼类开展系统发育遗传分析，并由此推测东方鲀属鱼类起源于印澳热带海域(东印度洋和西太平洋海域)。上述研究针对同一种鱼不同地理种群或养殖群体，利用传统的标记分析常常很难发现差异，而线粒体D-loop区丰富的变异可作为种群鉴定的一个很好的工具。本研究采用PCR、克隆结合DNA测序技术对目前国内尼罗罗非鱼3个主要养殖品系开展mtDNA D-loop分析，以期根据它们的基因片段多态性来揭示尼罗罗非鱼不同品系养殖群体的遗传多样性，了解尼罗罗非鱼的种质现状，为尼罗罗非鱼的保种选育工作提供参考建议。

1 材料与方法

1.1 试验材料

分别采自淡水渔业研究中心保种的“88品系”尼罗罗非鱼(简称XH)30尾，“99品系”尼罗罗非鱼(简称AN)30尾，吉富罗非鱼(简称GF)35尾。湘湖品系尼罗罗非鱼、埃及品系尼罗罗非鱼的选育是采用群体选育法，而吉富罗非鱼是采用家系选育法进行的选育。

1.2 实验试剂及仪器设备

PCR反应所用的Taq-DNA聚合酶、dNTPs、250 bp-ladder Marker等试剂均购于TaKaRa生物公司。电泳仪为BIO-BAD PowerPac Universal；PCR仪为Eppondorf Mastercycler Gradient；成像仪为Gene Company Limited G-box型凝胶成像系统。

1.3 基因组DNA的制备和检测

尾静脉取全血(ACD抗凝)，50 μl血液加裂解液(0.5 %十二烷基肌氨酸钠、0.02 %蛋白酶K、10 mmol/L EDTA) 200 μl，50 ℃温育2 h (其间不时摇动混匀)，酚-氯仿法抽提DNA，无水乙醇-20 ℃过夜沉淀1次，70 %酒精洗涤1次，干燥后加0.1×TE 50 μl溶解DNA，50倍稀释后即为模板用于PCR扩增0.8 %的琼脂糖凝胶电泳检测，稀释至100 ng/μl，4 ℃保存备用。

1.4 mtDNA D-loop区的PCR扩增

本实验拟扩增并测定罗非鱼mtDNA D-loop区的序列，参考吴长敬等[8]选择了用于扩增尼罗罗非鱼mtDNA D-loop序列的1对引物344F与PHE1R，引物由上海基康生物技术有限公司合成。引物序列为344F:5′-CTATTACTGGCATCTGGTTCC-3′和PHE1R:5′-ACATCTTCAGTGTTACGCTT-3′进行PCR扩增。

1.5 PCR产物检测与目的片段的测序

PCR扩增反应产物用0.8 %琼脂糖胶电泳，5 V/cm电泳0.5 h左右，G-Box记录电泳结果，将确定为目的片段的PCR扩增产物送上海基康生物技术有限公司进行正反向测序。

1.6 数据分析

先对正、反向序列进行重叠区拼接，除去多余的碱基片段(Contig-Express软件)。再对序列进行编辑校正(BioEdit软件)；之后进行BLAST分析(GenBank)，确认PCR得到的序列是罗非鱼mtDNA D-loop区部分序列。对编辑校正后的序列进行比对分析(ClustalX2软件)。分析序列特征，统计序列的碱基组成和变异情况，用Kimura2-parameter模型计算遗传距离，并构建NJ系统发育树(MEGA5软件)。统计品系的遗传多样性参数H单倍型多样度、K平均核酸差异数、Pi核苷酸多态性、Fst遗传分化指数以及品系间的基因流Nm值(DnaSPv5软件)。

2 结果与分析

2.1 罗非鱼mtDNA D-loop区部分序列结构特征

mtDNA D-loop序列片段在对比除去引物序列后，碱基序列长度为550～556 bp，部分序列出现碱基插入/缺失现象，导致序列出现长度的多态性。序列碱基组成见表1，3个品系的碱基组成基本一致，无显著差异。A、G、T、C 4个碱基的平均含量分别

表1 尼罗罗非鱼3个品系mtDNA D-loop序列碱基组成

为29.1 %、15.6 %、35.0 %、20. 2 %，可见其中碱基T的含量最高，碱基G的含量最低。A+T(平均为64.1 %)的含量明显高于G+C(平均为35.9 %)的含量。

2.2 罗非鱼不同品系的遗传结构分析

通过Mega 5软件统计控制区序列变异位点在不同选育品系中的分布，结果见表2。其中，3个品系的转换数>颠换数>插入/缺失数，总体转换/颠换比率为1.91。95尾罗非鱼共检测出27个单倍型，其中GF、AN共享1个单倍型(GF02与AN01相同)，XH、GF共享1个单倍型(XH03与GF08相同)，其他单倍型分别为各群体独有。

表2 尼罗罗非鱼3个品系mtDNA D-loop区序列变异

XH01～13:XH的13种单倍型；GF01～10:GF的10种单倍型；AN01～07:AN的7种单倍型；点(.)表示与第1条序列相同，短横线(-)表示插入或缺失XH01-13:the thirteen haplotypes of XH；GF01-10:the ten haplotypes of GF；AN01-07:the seven haplotypes of AN; Identity with the first sequence is denoted by dots(·) and insertion/deletion position is denoted by short horizontal lines(-)图1 尼罗罗非鱼3个品系mtDNA D-loop区部分序列变异Fig.1 Variations of partial sequence of D-loop region in three strains of tilapia

以27个单倍型的D-loop序列构建的NJ系统树及其在3个选育品系中的分布如图2所示。单倍型在3个养殖品系中的分布可以看出，各品系都已形成自己特有的单倍型类群，其中XH品系中XH02单倍型出现频率最高，包括9个个体；GF品系中GF05单倍型出现频率最高，包括12个个体；AN品系中AN01单倍型出现频率最高，包括18个个体。3个品系中AN01(GF02)单倍型出现频率最高，共23个。由拓扑结构可以看出，27种单倍型形成3大分支，3个选育品系的单倍型在NJ系统树上互相交叉，其中GF品系出现的单倍型(GF01、GF09)形成单独的一个进化枝，尼罗罗非鱼3个养殖品系在控制区序列变异水平上有各自的特点。

图2 27个单倍型的NJ系统树及其在尼罗罗非鱼各品系中的分布Fig.2 NJ phylogenetic tree of twenty-seven haplotypes and its distribution in different strains of tilapia

品系Strains单倍型多样度H平均核苷酸差异数K核苷酸多态性PiXH0.87120.130.0375GF0.83420.730.0380AN0.62821.800.0399

表4 3个品系间的基因交流Nm值(左下)和遗传分化Fst值(右上)

表5 3个品系间遗传距离(下三角)和标准差(上三角)

2.3 品系群体遗传多样性参数的统计

单倍型多样度大小依次排列为GF>XH>AN；平均核酸差异数大小依次为AN>GF>XH；核苷酸多态性(Pi)是衡量一个品系养殖群体mtDNA遗传多样性的重要指标，其大小排列依次为AN>GF>XH，其中AN品系多样性最高为0.399。

2.4 品系间遗传分化及遗传距离

从品系间遗传分化指数Fst和基因流Nm的角度对品系间的遗传分化进行分析(表4)，3个品系群体之间的遗传分化指数均大于0.05，已经产生了中等程度的遗传分化。GF和AN之间Nm>1，基因流在遗传分化中起了主要作用；XH与AN、GF之间Nm<1，遗传漂变在遗传分化起重要作用。

用Kimura 2-parameter 模型计算基于控制区部分序列差异的3个品系群体间遗传距离的D值(表5)。群体间的碱基序列的差异反映的是亲缘关系的远近。由表5可知，群体间的遗传距离以 XH与GF之间的值相对较大(0.070)，而GF与AN遗传距离较近(0.047)，XH与GF、AN之间的遗传距离显著大于GF与AN之间的遗传距离。

3 讨论与结论

人工选育过程中，经常出现不确定因素，如近交机率增加、有效群体容量不断减少等，有可能导致遗传多样性降低，从而降低遗传效应[9-10]，同时选育过程中群体纯度的提高又可以将优良经济性状稳定遗传到下一代中，具备极高的经济价值，因此了解不同品系的尼罗罗非鱼的遗传信息结构对于尼罗罗非鱼的种质改良和选育潜力挖掘等方面具有重要意义。本实验所测定的3个品系养殖群体的mtDNA D-loop区序列中，A、G、T、C 4个碱基的平均含量分别为29.1 %、15.6 %、35. 0 %、20. 2 %，由各碱基的含量可以看出，控制区序列的碱基组成呈现出很强的偏向性，在4 种碱基中，G的含量最低，T的含量最高；此外，尼罗罗非鱼控制区中A+T的含量(64.1 %)明显高于G+C的含量(35.9 %)，与脊椎动物线粒体DNA序列的碱基组成特点相符合[11]。在3个品系共检测到111个变异位点，其中转换65个，颠换34个，有12个插入/缺失位点，可见碱基的转换数明显大于颠换数，符合动物线粒体DNA碱基变异的特点，转换在近亲种间比较容易频繁的发生，颠换则在较远源种间逐渐显现。

Pi核苷酸多态性是分子遗传学中评价遗传多样性的灵敏指标，可用来衡量不同养殖品系的遗传多样性的高低。本研究中，3个选育群体的Pi值分别为0.0375、0.0380、0.0399，相比太湖鲢鱼(Hypophthalmichthysmolitrix)的平均Pi值为0.0124[12]，养殖刀鲚(Coilianasus)的平均Pi值为0.0099[13]，黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)的平均Pi值为0.0061[14]，本研究中的尼罗罗非鱼各品系养殖群体间mtDNA D-loop区多态性比较丰富。95个样本共检测出27个单倍型，在NJ系统树中27种单倍型形成了3大分支，推断这些单倍型可能来源于3个不同母系祖先。尼罗罗非鱼原产于非洲，其中XH、AN 2个品系是20世纪80～90年代我国从非洲尼罗河不同流域引进的原始群体，并在国内通过多代群体选育；而GF品系是由FAO通过对4个非洲原产地直接引进的尼罗罗非鱼品系(埃及、加纳、肯尼亚、塞内加尔)和4个在亚洲广泛养殖的尼罗罗非鱼品系(以色列、新加坡、泰国、中国台湾)进行家系选育而成[15]。尼罗河罗非鱼分布在尼罗河周边了维多利亚湖、艾伯特湖等多个水系，由于一定的地理因素使得不同生境的尼罗罗非鱼可能具有不同遗传背景的母系来源[16-17]，而吉富罗非鱼又是多个品系杂交而成，母本来源更加复杂，单倍型结果分析也较好地印证了以上因素。

由单倍型在3个品系养殖群体中的分布可以看出，GF品系与AN、XH品系分别共享1个单倍型，其他25个单倍型均为3个品系独有。NJ系统树上3个品系的单倍型在互相交叉，但同时GF品系中GF01、GF09单倍型形成独有的进化枝，说明GF品系在控制区序列变异水平上具备独特的遗传结构。从群体遗传分化指数Fst对品系间的遗传分化进行分析，Wright[18]认为，遗传分化指数Fst<0.05表示群体间无遗传分化发生，3个选育品系之间的遗传分化指数均大于0.05，说明它们之间已经产生了中等程度的遗传分化。而理论上Nm< 1时，遗传漂变是群体间遗传分化的主要因素；Nm> 1，基因流为主要作用[19]。XH与GF、AN之间基因流均小于1，遗传漂变在遗传分化中起了主要作用；而GF与AN之间基因流大于1，在遗传分化中起了主要作用，阻止了由遗传漂变引起的遗传分化。同时在遗传距离方面还是Fst方面，XH品系与AN、GF品系间遗传距离大于AN与GF之间的遗传距离，说明相比XH品系AN与GF亲缘关系较近。遗传结构研究表明3个选育品系目前仍具备较高的选育潜力，研究结果为后续的尼罗罗非鱼的种质改良和选育潜力挖掘积累了遗传背景信息，为罗非鱼选育工作提供了理论依据。

[1]肖 炜, 杨 弘, 李大宇, 等. 同种罗非鱼(Tilapia)不同地区选育群体的遗传多样性分析[J]. 海洋与湖沼, 2010, 41(4):530-537.

[2]Rosel P E, Haygood M G, Perrin W F. Phylogenetic relationships among the true porpoises (CetaceaPhocoenidae)[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution, 1995, 4(4):463-474.

[3]Beheregaray L B, Sunnucks P. Fine-scale genetic structure, estuarine colonization and incipient speciation in the marine silverside fishOdontesthesargentinensis[J]. Molecular Ecology, 2001, 10(12):2849-2866.

[4]Ryota Y, Akira G. Phylogeography of a freshwater sculpin,Cottusnozawae, from the northeastern part of Honshu Island, Japan [J]. Ichthological Research, 2002, 49(2):147-155.

[5]Nakadate M, Kusano T, Fushimi H, et al. Multiple spawning of captive Pacific bluefin tuna(Thunnusorientalis) as revealed by mitochondrial DNA analysis[J]. Aquaculture, 2011, 310(3):325-328.

[6]刘红艳, 江世贵, 苏天凤, 等. 3个水域黄鳍鲷线粒体 DNA D-loop 基因序列多态性研究[J]. 水产学报, 2004, 28(4):371-374.

[7]张玉波, 甘小妮, 何舜平. 线粒体D-loop序列变异与东方鲀属鱼类系统发育[J]. 水生生物学报, 2009, 33(4):656-663.

[8]吴长敬, 邹芝英, 杨 弘, 等. 罗非鱼mtDNA D-loop区部分序列结构和种群遗传多样性分析[J]. 动物学杂志, 2010, 45(5):121-128.

[9]Wolfus G M, Garcia D K, Alcivar-Warren A. Application of the microsatellite technique for analyzing genetic diversity in shrimp breeding programs[J]. Aquaculture, 1997,152:35-47.

[10]颉晓勇, 李思发, 蔡完其.吉富品系尼罗罗非鱼选育过程中遗传变异的微卫星分析[J]. 水产学报, 2007, 31(3):385-390.

[11]Broughton R E, Milam J E, Roe B A, et al. The complete sequence of the zebrafish (Daniorerio) mitochondrial genome and evolutionary patterns in vertebrate mitochondrial DNA[J]. Genome Research, 2001, 11(11):1958-1967.

[12]王茂元, 杨 弘, 邹芝英, 等. 太湖鲢鱼mtDNA D-loop区遗传多样性[J]. 中国农学通报, 2009, 25(13):263-267.

[13]徐钢春, 魏广莲, 李建林, 等. 基于线粒体 DNA D-loop 序列分析养殖刀鲚与湖鲚的遗传多样性[J]. 大连海洋大学学报, 2012, 27(5):448-452.

[14]刘朋朋, 钟立强, 潘建林, 等. 基于线粒体D-loop区分析黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)五个淡水湖泊群体的遗传多样性[J]. 海洋与湖沼, 2013, 44(3):728-733.

[15]何 杰, 徐 跑, 董在杰, 等. 吉富品系尼罗罗非鱼(GIFT)群体内的形态差异与分化[J]. 中国水产科学, 2009, 16(1):54-60.

[16]Hassanien H A, Gilbey J. Genetic diversity and differentiation of Nile tilapia (Oreochromisniloticus) revealed by DNA microsatellites[J]. Aquaculture Research, 2005, 36(14):1450-1457.

[17]Bezault E, Balaresque P, Toguyeni A, et al. Spatial and temporal variation in population genetic structure of wild Nile tilapia (Oreochromisniloticus) across Africa[J]. BMC Genet, 2011, 12(1):102.

[18]Wright S. Evolution and the genetics of populations[M]. Chicago:University of Chicago Press, 1978:1-30.

[19]Slatkin M. Gene flow and the geographic structure of natural populations[J]. Science, 1987, 236:787-792.

(责任编辑 陈 虹)

Genetic Variation of Mitochondrial DNA D-loop Sequences from Different Strains of Nile tilapia,Oreochromisniloticus

XIAO Wei, LI Da-yu, ZOU Zhi-ying, ZHU Jing-lin, HAN Jue, YANG Hong*

(Key Laboratory of Freshwater Fisheries and Germplasm Resources Utilization, Ministry of Agriculture, Freshwater Fisheries Research Center, Chinese Academy of Fishery Sciences, Jiangsu Wuxi 214081, China)

The mitochondrial DNA D-loop sequences of ninety-five individuals from three dominated tilapia culture strains [Nile tilapia ‘88 strain’(XH), ‘99 strain’(AN) and GIFT strain(GF)]were studied to understand the differences of the genetic structure, breeding effect and genetic potential of the three strain populations. The results showed that:(i)The length of their region sequences from three populations was 550-556 bp, including 111 variable sites, of which the transition, transversion and insert/deletion sites number were 65, 34 and 12, respectively, polymorphic loci occupying 18.64 % in total sites.(ii)There were 27 haplotypes in three strain populations, which was 12 for XH strain, 7 for AN strain and 10 for GF strain, respectively, of which GF and AN shared a haplotype, XH and GF shared another haplotype, and others were exclusive to each strain. The haplotypes of three strains crossed each other in the NJ tree but two special haplotypes of GF formed a unique clade. (iii)TheFstvalues among three strain populations were all more than 0.05, which indicated that the genetic differentiation among them was moderate, of which the genetic drift played a major role between XH and AN, XH and GF, otherwise the gene flow played a main role between AN and GF. It was concluded that there was a high level of genetic diversity in three Nile tilapia strain populations, and there were moderate genetic differentiation and a high proportion of unique haplotypes among three strain populations, which indicated that the three tilapia strains still had a full potentiality in breeding selection.

Nile tilapia; Aquaculture strains; Genetic structure; Mitochondrial DNA D-loop; Genetic differentiation

1001-4829(2016)11-2752-06

10.16213/j.cnki.scjas.2016.11.044

2015-11-14

现代农业产业技术体系专项资金(CARS-49)；中央级公益性科研院所基本科研业务费(2015JBFM18)；现代农业人才支撑计划(2130106)

肖 炜(1982-)，男，江苏宜兴人，助理研究员，主要从事罗非鱼遗传育种研究，E-mail xiaow@ffrc.cn，*为通讯作者，E-mail yangh@ffrc.cn。

S917.4

A