不同方法提取费约果叶片香气成分的比较研究

白俊英,黄仁华,陆云梅,余 游,王 丹

(西南科技大学生命科学与工程学院,四川绵阳 621010)



不同方法提取费约果叶片香气成分的比较研究

白俊英,黄仁华*,陆云梅,余 游,王 丹

(西南科技大学生命科学与工程学院,四川绵阳 621010)

分别采用索氏抽提法、超声波辅助溶剂萃取法和顶空固相微萃取法对费约果叶片中所含香气成分进行提取,经GC-MS进行分析,结合谱库检索技术,采用峰面积归一化法进行定性和定量分析。结果表明,索氏抽提法所得香气物质中鉴定出挥发性成分20种,占总挥发性成分的70.357%,且以烷烃为主,超声波辅助溶剂萃取法所得香气物质中鉴定出挥发性成分17种,占总挥发性成分的65.222%,且以酯类为主,顶空固相微萃取法所得香气物质中鉴定出挥发性成分最多,有42种,占总挥发性成分的76.899%,且以萜烯类为主。由此可见,在费约果叶片香气成分分析中顶空固相微萃取法能得到最多的香气组分,索氏抽提法次之,超声波辅助溶剂萃取法得到的香气物质最少。

索氏抽提,超声波辅助溶剂萃取,顶空固相微萃取,香气成分

目前,关于天然植物香气成分提取方面的报道有很多,提取的方法也多种多样,陈常颂等[1]利用同时蒸馏萃取法(SDE)提取茶叶香精油;谢吉林等[2]利用减压蒸馏法(VDE)提取普洱茶香气物质;刘煜宇等[3]利用超临界二氧化碳萃取技术(SFE)提取烟草花香气成分;王延平等[4]采用固相微萃取(SPME)提取大红袍茶提取物的挥发性致香成分。顶空固相微萃取技术(HS-SPME)是上世纪九十年代发展起来的新的样品预处理技术,特别适用于微量样品的分析。顶空固相微萃取技术在固相微萃取技术的基础上直接采用萃取头顶空吸附进样,具有操作简便快捷、无试剂污染等重要特点[5]。香气物质的检测通过气相色谱-质谱(GC-MS)分析技术,能得到较好的定性、定量结果[6]。

费约果是一种集食用、药用、园艺观赏于一体的新兴果树,原产于阿根廷北部,乌拉圭、巴拉圭山区一带,目前在世界多个国家有种植且在新西兰生产、发展最好[7-8]。费约果果实、花、叶皆散发出浓郁香味,且含多种多酚类有效成分,具有一定的食用药用价值和广阔的应用前景[9-12]。相应产品在国际国内市场上皆供不应求。费约果叶片四季常绿,耐修剪,成熟叶片呈浓绿色革质,厚实且有光泽,修剪后散发令人愉快的芬芳气味,可作为食品、化妆品添加剂的重要来源。在美洲、新西兰等地,费约果为常见庭院植物,枝叶修剪每年产生大量垃圾,叶片资源往往被浪费掉;而中国的费约果引种栽培已有十余年时间,在广大科研工作者的努力下,未来必将走进千家万户。可以预见,对费约果的深入研究必将促进新兴果树费约果在国内外的发展。据此,本研究对费约果叶片香气成分进行了提取,并比较了顶空固相微萃取法与传统的索氏抽提法和溶剂萃取法在费约果香气分析方面的异同,以求为费约果叶片香气成分的开发利用及后期相关研究提供一定的研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

费约果 四川绵阳,品种为“库利激”两年生洁净叶片,于2015年5月7日上午9时采摘于西南科技大学西山校区费约果种植园;乙醚、无水氯化钙 分析纯;丙酮 色谱纯;水 超纯水。

Varian 3900-Saturn 2100气相色谱-质谱联用仪、气相色谱-质谱口进样针 美国Agilent公司;固相微萃取萃取手柄和Carboxen®/聚二甲基硅氧烷(CAR/PDMS,75 μm)萃取头 美国Supelco公司;20 mL顶空瓶 四川生科力科技有限公司;HH型数显恒温水浴锅 金坛市金城国胜实验仪器厂;SZF-06A型脂肪测定仪 上海华睿仪器有限公司;电子天平 赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;FW100型高速万能粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司;PH-030(A)型干燥/培养二用箱箱 上海齐欣科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 索氏抽提法 取新鲜费约果叶片若干,冷冻干燥后用万能粉碎机粉碎,准确称取费约果叶片粉末4 g于滤纸筒中,包扎好后置于索氏抽提器的抽提筒内,组装好索氏抽提装置后,用100 mL乙醚索氏提取至回流溶剂无色。重复3组,合并提取液。回收乙醚至约150 mL。加入无水氯化钙颗粒8 g,脱水过夜。过滤后收集滤液,冷藏密封保存,备用。GC-MS进样分析时取5 mL样液稀释3倍,取1 μL进样测定。

1.2.2 超声波辅助溶剂萃取法 取新鲜费约果叶片若干,冷冻干燥后用万能粉碎机粉碎,准确称取费约果叶片粉末10 g于锥形瓶中,加入100 mL乙醚,密封,超声30 min后,取上清液于另一锥形瓶中,残渣中再加入100 mL乙醚,重复提取3次,合并三次浸提液(墨绿色带暗红状)。将浸提液旋转浓缩至约150 mL。加入无水氯化钙颗粒8 g,脱水过夜。过滤后收集滤液,冷藏密封保存,备用。GC-MS进样分析时取5 mL样液稀释3倍,取1 μL进样测定。

1.2.3 顶空固相微萃取法 取新鲜费约果叶片若干,冷冻干燥后用万能粉碎机粉碎,准确称取费约果叶片粉末1.5 g置于20 mL顶空瓶中,用具有聚四氟乙烯垫密封盖密封,将瓶放在60 ℃水浴锅中水浴平衡30 min后,将老化(首次使用时,萃取头需要在气相色谱进样口老化,温度300 ℃,时间30 min;以后每次使用前需在250 ℃下处理30 min,以确保脱去其可能吸附的挥发性成分)后的75 μm CAR/PDMS萃取头迅速插入样品瓶顶空部分,距离样品一定高度,于60 ℃加热吸附40 min,吸附后的萃取头取出,并迅速插入气相色谱进样口,于250 ℃解析6 min,用于GC-MS分析,同时启动仪器采集数据。

1.3 GC-MS测定条件

1.3.1 色谱条件 实验采用Varian 3900-Saturn 2100 GC-MS,色谱柱为HP-5MS,含5%苯甲基聚硅氧烷弹性石英毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),色谱进样口温度:250 ℃,进样量1 μL,柱室温度:40 ℃,保持1 min,采用程序升温以5 ℃/min的升温速率升至240 ℃,保持15 min,载气:高纯氦气,流速1 mL/min,不分流进样,柱流量1 μL/min。

1.3.2 质谱条件 质谱接口温度:220 ℃,电离方式:EI,电子能量:70 eV,离子源温度:190 ℃;四级杆温度:210 ℃,调谐方式:标准调谐,质量扫描方式:SCAN,溶剂延长:3 min,扫描模式:全扫描参数,质量扫描范围:40～300 amu。

1.3.3 GC-MS测定方法 方法参考吕世懂等[13]并结合仪器操作规程和具体实际。先用丙酮洗涤GC-MS联用仪进样针6次以上,然后用待测样液润洗6次以上,排除其它物质干扰。待GC柱室温度升至设定温度后,开始进样。用进样针吸取1 μL样液,迅速注入进样口中,缩出进样针。开始测试。样品经GC-MS分析,各分离组分利用谱图库工作站数据处理系统采用峰面积归一化法进行相对定量分析,求得各挥发性成分相对含量及离子峰出峰个数。

2 结果与分析

2.1 费约果叶片香气成分GC-MS分析结果

图1为不同方法提取费约果叶片挥发性成分所得化合物的GC-MS总离子流色谱图。由图可知,不同方法所得离子流色谱图中,各色谱峰保留时间和峰强度有所差异。索氏抽提法能够得到20种化合物,超声波辅助溶剂萃取法能够得到17种化合物,顶空固相微萃取法能够得到42种化合物。

图1 不同方法提取费约果叶片香气成分总离子流图Fig.1 Total ionic chromatograms of aroma components in feijoa leaves by different methods注：a-索氏抽提法,b-超声波辅助溶剂萃取法,c-顶空固相微萃取法。

各成分的色谱峰经质谱扫描后得到相应的质谱图,经计算机谱库检索分析,并结合相关文献,鉴定出香气成分,以峰面积归一化法确定各组分的相对含量。结果如表1所示。

2.2 不同提取方法提取费约果叶片所得香气成分分析

索氏抽提法提取的香精油经GC-MS分析后,检测到36个峰,在检测时间内共鉴定出20个香气组分。含量最高的是烃类,其次是醇类,随后是酯类、萜烯类、其它类和醛酮类,分别占香气总量的34.669%、18.989%、7.429%、6.957%、1.765%、0.548%。由此可见,索氏抽提法为含烷烃成分和醇类成分较多的样品的分析提供了参考。其中,2,3-丁二醇可用于制备油墨、香水、熏蒸剂、增湿剂、软化剂、增塑剂、炸药及药物手性载体等,在我国往往被添加到白酒中,以改善风味。

表1 三种方法提取费约果叶片挥发性成分分析

Table 1 GC-MS analysis results of aroma components in feijoa leaves by different extraction methods

序号化合物名称分子式相对分子量相对含量(%)索氏抽提超声波辅助溶剂萃取顶空固相微萃取醇类12，3-丁二醇C4H10O2907974--2(2R，3R)-(-)-2，3-丁二醇C4H10O290-0481-3(R)-(-)-2-戊醇C5H12O88-0155-43-甲基-2-丁醇C5H12O8805630573-52-异丙氧基乙醇C5H12O210410106--61-己炔-3-醇C6H10O98--01387反-2-甲基环戊醇C6H12O100--07958叶醇C6H12O100--41909(E)-2-己烯-1-醇C6H12O100--0157

续表

续表

注:表中“-”表示未检测到。超声波辅助溶剂萃取法提取的香精油经GC-MS分析后,检测到26个峰,在检测时间内共鉴定出17个香气组分。其中,含量最高的是酯类,其次是萜烯类,随后是烃类、其它类、醛酮类和醇类,分别占香气总量的32.591%,20.652%,6.742%、1.855%、1.742%、1.640%。由此可见,超声波辅助溶剂萃取法为含酯类成分和萜烯类成分较多的样品的分析提供了参考。萃取出的组分中己酸丁酯呈清香、蜡香,有菠萝和葡萄酒似香气。

顶空固相微萃取法提取的香精油经GC-MS分析后,检测到63个峰,在检测时间内共鉴定出42个香气组分。其中,含量最高的是萜烯类,有20种,其次是醇类,有10种,随后是醛酮类、酯类、烃类、其它类和醚类,分别占香气总量的45.627%,14.860%,10.752%、3.481%、1.656%、0.420%、0.103%。由此可见,顶空固相微萃取法为含萜烯类成分和醇类成分较多的样品的分析提供了参考。提取出的组分中1-石竹烯是国标允许使用的食品香料,具有辛香、木香、柑橘香、樟脑香和温和的丁香香气;α-荜澄茄油萜具有花似的、柠檬的香气;水芹烯具有令人愉快的、新鲜的、柑橘的、胡椒的气味。

2.3 不同方法提取费约果叶片香气成分的比较

由表1可知,三种方法共鉴定出费约果叶片中66种香气成分。其中,2,3-丁二醇、2-异丙氧基乙醇、3-羟基-2-丁酮、2-乙基-2,4,5-三甲基-1,3-二氧杂环戊烷、2-甲氧基甲基-2,4,5-三甲基-1,3-二氧杂环戊烷、1,3,5-环庚三烯、(S)-(-)-乳酸异丙酯、乙酸-3-辛醇酯、萘只在索氏抽提法所得的香气组分中出现；(2R,3R)-(-)-2,3-丁二醇、(R)-(-)-2-戊醇、5-甲基-4-正辛醇、L-(-)-甘油醛、γ-古芸烯、己酸丁酯、十五烷酸-14-甲酯只在超声波辅助溶剂萃取法中出现,且己酸丁酯含量最高；顶空固相微萃取法所得香气组分中鉴别出的物质最多,且有36种组分只在顶空固相微萃取法中出现,其中,多为萜烯类。

索氏抽提法和超声波辅助溶剂萃取法所得香气组分中共有物质较多,包括:3-甲基-2-丁醇、2-十六烷醇、2,4,5-三甲基-1,3-二氧杂环戊烷、1,1-二乙氧基乙烷、[2.4]七螺-4,6-二烯烃、香橙烯、乙基苯、2,6-二叔丁酰基-对苯二酚(氢醌),8种,其中2,4,5-三甲基-1,3-二氧杂环戊烷和[2.4]七螺-4,6-二烯烃在两种方法中含量均较高。索氏抽提法和顶空固相微萃取法中共有物为γ-榄香烯、大根香叶烯D、荜澄茄油萜。超声波辅助溶剂萃取法和顶空固相微萃取法中共有物质为l-去氢白菖烯、1-石竹烯。

3 讨论

索氏抽提法可以避免溶剂的挥发损失且溶剂可回收,但在一定温度下长时间进行反应,可能造成有效成分的破坏,因而只能反映费约果叶片部分香气特性;超声波辅助溶剂萃取法萃取时间短,温度低,萃取彻底,但超声波产生的空化作用可能造成某些香气成分产生化学变化[14];顶空固相微萃取法直接在顶空部分萃取样品,简便快捷,目标物损失少,所以能得到相对最多的香气组分,但顶空固相微萃取加热温度低,萃取物多为挥发性成分,可能遗漏高沸点物质和半挥发性物质。索氏抽提法和超声波辅助溶剂萃取法的提取原理都是溶剂萃取,溶剂相同,所以得到较多共同组分。顶空固相微萃取法的萃取原理是一定温度下挥发性成分在萃取纤维上的富集与解析,与溶剂萃取差异较大,所得香气组分差异也大。在鉴定出的物质中,没有一种香气物质在三种方法中同时出现,可能是因为三种方法的共有物质未能被鉴定,也可能是因为顶空固相微萃取法针对的是低沸点物质和挥发性强的物质,而索氏抽提法和超声波辅助溶剂萃取法得到的物质沸点较高且在乙醚中溶解性强。具体原因有待进一步研究。

三种方法提取费约果叶片所得香气成分主要为醇类、萜烯类、醛酮类、酯类、烃类、醚类和其它,各种物质特有的香味相长相消、相互配合,最终构成了费约果叶片复杂而独特的香气。费约果叶片悦人的香气不仅与叶片中香气组分的含量有关,还与各组分的气味阈值相关联[15]。各类物质香气组分的阈值及其对费约果叶片香气的贡献还有待进一步研究。

4 结论

索氏抽提法提取的物质经GC-MS分析后,检测到36个峰,在检测时间内共鉴定出20种香气成分。超声波辅助溶剂萃取法提取的物质经GC-MS分析后,检测到26个峰,鉴定出17种香气成分。顶空固相微萃取法提取的物质经GC-MS分析后,检测到63个峰,鉴定出42个香气组分。就得到的香气成分种类而言,顶空固相微萃取法效果最好,索氏抽提法次之,超声波辅助溶剂萃取法得到最少的香气组分。三种方法鉴别出的总香气组分有66种,每种提取方法所得香气组分种类及含量各有不同,说明三种提取方法各有特色,能很好实现互补。在实际分析中,同时采用几种不同提取方法所得物质更能全方位反映样品组成及性质。在不同要求的研究和应用中,可根据不同方法提取费约果叶片香气成分中不同组分的呈香特点及含量将其应用到需求中,如稀有香味物质制成高档香料或据其特点进行人工合成,量大且常见的香气物质可作为普通香味添加剂天然来源。

[1]陈常颂,张应根,钟秋生,等. 同时蒸馏萃取法分析4种台式乌龙茶香气成分[J]. 食品与发酵工业,2011,02:165-171.

[2]谢吉林,肖海军,鲍治帆,等. HS-SPME和VDE两种方法对普洱茶香气成分分析的比较研究[J]. 云南农业大学学报,2014,06:873-879.

[3]刘煜宇,李仙,念小魁,等. 响应面法优化烟草花超临界二氧化碳萃取工艺及香气分析[J]. 烟草科技,2013,06:45-49.

[4]王延平,梁俪恩. SPME-GC/MS法测定大红袍茶及茶叶蛋卤水味包中的挥发性致香成分[J]. 食品工业科技,2014,10:90-94.

[5]肖丹. 顶空固相微萃取技术的应用与展望[J]. 中国卫生工程学,2015,01:88-92.

[6]孔程仕,徐兴英. 气质联用技术(GC-MS)在葡萄酒香气成分分析中研究进展[J]. 饮料工业,2012,15(3):43-46.

[7]Nodari R O,Guerra M P,Meler K,et al. Genetic variability of Feijoa sellowiana germpl asm[J]. Acta Hort,1997,452:41-46.

[8]王丹,袁小红,熊双丽,等. 费约果营养、生物活性成分及应用研究进展[J]. 食品与生物技术学报,2015,04:337-348.

[9]NAKASHIMA H. Biological activity of Feijoa peel extract[J]. Kagoshima University Research Center for the Pacific Islands,Occasional Papers,2001,34:169-175.

[10]ROSSI A,RRGANOI D,PERGOLA C,et al. Inhibition of inducible nitric oxide synthase expression by an acetonic extract from Feijoa sellowiana Berg. fruits[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2007,55(13):5053-5061.

[11]BEYHAN Ö,ELMASTAS M,GEDIKLI F. Total phenolic compounds and antioxidant capacity of leaf,dry fruit and fresh fruit of feijoa(Acca sellowiana,Myrtaceae)[J]. Journal of Medicinal Plants Research,2010,4:1065-1072.

[12]Thorp G,Bieleski R. Feijoas:Origins,Cultivation and Uses[M]. Hort Research,Ed. David Bateman,2002:11-12.

[13]吕世懂,姜东华,杨凡,等. 顶空固相微萃取/GC-MS分析普洱熟茶与安化黑茶香气成分[J]. 热带作物学报,2013,34(8):1583-1591.

[14]王涓,潘忠礼,马海乐,等. 超声波的空化作用及其对多酚稳定性的影响[J]. 食品工业科技,2014,35(19):388-391.

[15]罗玉龙,靳志敏,刘夏炜,等. 肉制品中香味物质形成原因研究进展[J]. 食品与发酵工业,2015,41(2):254-258.

Comparison of aromatic components infeijoasellowianawith different extraction methods

BAI Jun-ying,HUANG Ren-hua*,LU Yun-mei,YU You,WANG Dan

(Southwest University of Science and Technology,College of Life Science and Engineering,Mianyang 621010,China)

ThearomaticcomponentsinfruitofFeijoa sellowianawereextractedbysoxhletextraction,ultrasonicassistedsolventextraction,andheadspacesolidphasemicro-extraction,analyzedbygaschromatography-massspectrometry,combinedwiththespectrallibraryretrievaltechnology,anddeterminedbypeakareanormalizationmethod.Theresultsshowedthattherewere20compoundsidentifiedbysoxhletextractionandthepercentoftotalpeakareawas70.357%andthemajorcompoundwasalkane,therewere17compoundsidentifiedbyultrasonicassistedsolventextractionandthepercentoftotalpeakareawas65.222%andthemajorcompoundswasester,andtherewere42compoundsbyheadspacesolidphasemicro-extraction,76.899%oftotalpeakareaandthemajorcompoundswasterpenoid.Thisshowedthatthemostkindofaromacompositionscanbeobtainedbyheadspacesolidphasemicro-extraction,followedbysoxhletextraction,andtheleastaromacompositionscanbeobtainedbyultrasonicassistedsolventextraction.

soxhletextraction;ultrasonicassistedsolventextraction;headspacesolidphasemicro-extraction;aromaticcomponents

2016-03-14

白俊英(1991-)，女，硕士研究生，研究方向：天然产物有效成分，E-mail：337327450@qq.com。

*通讯作者:黄仁华(1979-)，男，博士，副教授，研究方向：植物有效成分功能研究及开发利用， E-mail：huangrenhua@swust.edu.cn。

国家自然科学基金(31000259);四川省科技厅“十一五”科技项目(14zs2105)；校实验室开放基金(15xnkf03)。

TS201.2

A

1002-0306(2016)19-0302-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.19.050