有氧呼吸对乳酸乳球菌代谢途径的影响及其潜在应用展望

李柏良,刘 飞,于上富,杜金城,靳 妲，蒙月月，李 娜，闫芬芬,霍贵成

(东北农业大学,乳品科学教育部重点实验室,黑龙江哈尔滨 150030)



有氧呼吸对乳酸乳球菌代谢途径的影响及其潜在应用展望

李柏良,刘 飞,于上富,杜金城,靳 妲，蒙月月，李 娜，闫芬芬,霍贵成*

(东北农业大学,乳品科学教育部重点实验室,黑龙江哈尔滨 150030)

作为兼性厌氧菌,乳酸乳球菌具有双重的代谢模式,既可以在厌氧条件下进行传统的发酵代谢,也可以在添加血红素且通氧的条件下进行有氧呼吸代谢。本文综述了乳酸乳球菌有氧呼吸代谢的遗传基础的必备元件、显著的生理学变化、实际和潜在应用。乳酸乳球菌在进行有氧呼吸代谢时具有生物量显著增加、延长存活率、降低氧胁迫和酸胁迫等优势,具有巨大的应用潜力。随着乳酸乳球菌有氧呼吸代谢的深入研究,我们可以更好地挖掘乳酸乳球菌的代谢模式和开发乳酸乳球菌的全部潜力。

乳酸乳球菌,有氧呼吸作用,血红素,遗传基础,生理学变化

乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)是球形、不产生孢子的革兰氏阳性菌,属于嗜温菌,最适生长温度是30 ℃。乳酸乳球菌的特点是菌落较小,有光泽,菌体卵圆形,成对或成串出现,因此最初被分在链球菌属中,直到1985年才被分为乳酸乳球菌属[1]。乳酸乳球菌可以分为4个亚种,即 乳酸乳球菌乳酸亚种L.lactissubsp.lactis、乳酸乳球菌乳脂亚种L.lactissubsp.cremoris、乳酸球菌霍氏亚种L.lactissubsp.hordniae[2]和L.lactissubsp.tructae[3],乳酸亚种和霍氏亚种间的表型和基因型差异均很小[2]。

乳球菌被广泛应用于发酵乳制品的生产,如干酪、酸奶和酸奶油等,另外,它也应用于口服疫苗和外源蛋白的生产。乳酸乳球菌的核心应用是干酪生产的发酵剂,其中乳脂亚种主要用来生产硬质干酪,而乳酸亚种常被用来生产软质干酪。乳酸乳球菌能够赋予发酵乳制品良好的质地和风味,具有极高的工业和经济价值[2]。乳酸乳球菌属于兼性厌氧型,在发酵乳制品生产过程中,氧气会导致乳酸乳球菌细胞损伤甚至死亡,直接影响发酵过程和风味物质的产生。乳酸乳球菌在进行厌氧发酵过程中主要以产乳酸为主,而且容易受到环境中氧气的胁迫,导致生长缓慢;然而,乳酸乳球菌在进行有氧呼吸代谢时生物量显著增加、存活率延长、获得更高的能量、降低细胞受到的酸应激和氧化应激。因此,深入研究乳酸乳球菌的有氧呼吸作用与代谢途径的关系具有重要的意义。

1 乳酸乳球菌有氧呼吸作用的遗传基础

如图1所示,乳酸乳球菌进行有氧呼吸需要三个主要的跨膜元件:作为电子供体的NADH脱氢酶,由noxA和noxB基因编码;作为电子传递体的甲基萘醌,由menA基因和menFDXBEC基因簇编码的酶合成;作为电子受体、活性依赖血红素的bd型细胞色素氧化酶,由cydA,cydB,cydC,cydD基因编码,cydA和cydB基因是细胞色素氧化酶的结构基因,cydC和cydD基因编码的复合物主要负责细胞色素氧化酶的组装和运输。乳酸乳球菌进行有氧呼吸时需要外源的血红素,因为它缺乏部分血红素的合成基因。还有一些乳酸菌缺乏甲基萘醌的合成基因,意味着这些乳酸菌需要2种外源物质才能激活有氧呼吸链[4]。因此,乳酸乳球菌进行有呼吸代谢的遗传基础是具备编码NADH脱氢酶的noxA和noxB基因,编码甲基萘醌合成酶的menA基因和menFDXBEC基因簇以及编码细胞色素氧化酶的cydA,cydB,cydC,cydD基因。

图1 乳酸乳球菌的有氧呼吸链[5]Fig.1 Respiratory chain components in Lactococcus lactis[5]注:有氧呼吸链由电子供体、电子传递体和终端氧化酶构成,下方红色的基因是乳酸乳球菌中的相关基因。

2 有氧呼吸对乳酸菌代谢途径的主要影响

NADH和NAD+的比例会对代谢途径中的关键酶选择哪种辅因子产生影响。在糖转化为丙酮酸的过程NAD+被还原生成NADH,如果要使糖酵解过程连续进行就需要有NAD+的再生途径。在发酵条件下,乳酸乳球菌不具备完整的电子传递链,也就无法通过呼吸链完成NAD+的再生,乳酸乳球菌可以使丙酮酸通过乳酸脱氢酶转化成乳酸,同时NADH也被氧化生成NAD+,完成了的NAD+再生[6]。当在血红素和氧气同时存在下,有氧呼吸链可以激活NADH氧化酶的活性,生成NAD+,导致NADH代谢池减少,NADH与NAD+的比值下降,进而引起代谢途径的改变[7]。

2.1 有氧呼吸中的碳代谢

产生乳酸的乳酸脱氢酶需要依赖NADH作为辅酶,NADH氧化酶将和乳酸脱氢酶竞争NADH。因此,乳酸乳球菌进行有氧呼吸时会比发酵代谢(发酵过代谢的过程中有90%代谢的产物是乳酸)产生的乳酸少,而乙酸的产量大大增加,转变成混合酸发酵,环境酸化变慢,最终的pH升高,可以更高效的利用碳源,使得生物量显著增加。较低的乳酸脱氢酶酶活使得丙酮酸代谢流朝着次级代谢产物乙偶姻和双乙酰的方向发展,据报道,乳酸乳球菌在有氧呼吸的过程中有接近20%的葡萄糖转化为乙偶姻[8]。模式菌株L.lactissubsp.cremorisMG1363和工业菌株L.lactissubsp.lactisCHCC2862进入有氧呼吸后期时,NAD依赖的丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase,Pdh)和乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase,Als)的活性增加,并且产生双乙酰和乙偶姻的大量积累,出现二次生长现象[9]。辅因子可以引起很多的代谢途径发生改变,因此在有氧呼吸过程中代谢产物的变化的是十分明显的[10]。

分解代谢控制蛋白(catabolic control protein A,CcpA)在有氧呼吸代谢中起决定性的作用。向处于迟滞期的乳酸乳球菌培养基中加入血红素会出现生长抑制和细胞的死亡的现象[11]。这种毒性是由于血红素的提前摄入而激活的氧胁迫引起的。Gaudu等鉴定了血红素转运系统的抑制因子,结果发现它是CcpA激活的靶位点[12]。因此我们推断CcpA介导的抑制血红素的摄入是乳酸乳球菌阻止其在对数生长期开始时发生氧化损伤的一种方式。

2.2 有氧呼吸中的氮代谢

乳酸乳球菌都含有细胞壁粘附蛋白(cell-envelope proteinase,CEP)和很多胞内的肽酶,它们可以降解蛋白质和多肽,以利于其在“贫瘠”的营养条件下进行生长。相比之下,在氨基酸丰富的培养条件下会产生较少的肽酶,肽酶的产量通过全局转录调控因子CodY进行控制。最新研究表明还有其他的氮源调控因子,GlnR(氮源调控蛋白)[13]。GlnR通过控制amtB-glnK、glnA、glnP3个基因的表达量来分别控制铵/氨的摄取,谷氨酸合成酶的活力,谷氨酸盐的转运的能力[14-15]。.乳酸乳球菌在有氧呼吸条件下氮平衡调控是更加复杂的:乳酸乳球菌在有氧呼吸条件下可能存在另一个氮源平衡的调控因子,因为在CodY发生缺失突变的情况下,受CodY调控的pepO1基因仍然出现表达上调的现象[16];乳酸乳球菌充分进行有氧呼吸后,通过GlnR诱导amtB-glnK基因表达而使谷氨酸盐处于较低的水平,而其他的受GlnR调控的基因却没有变化[16]。乳酸乳球菌有氧呼吸代谢的进一步研究可能揭示乳球菌其他的氮源平衡调控机制[17]。

一定浓度的脯氨酸在细胞内可以稳定蛋白质,防止蛋白质在胁迫条件下失去活力,脯氨酸的外排对与其共生的脯氨酸缺陷型细菌也是十分有利的,另外,脯氨酸的外排也有利于乳酸乳球菌提高抗逆能力,这样使乳酸乳球菌可以适应不良的环境,维持良好的生长状况。乳酸乳球菌进行有氧呼吸时脯氨酸大幅度增加,其原因可能是pepO1基因的表达[16]。肽酶PepO1可以将脯氨酸从含有丰富脯氨酸的多肽中水解出来,通常情况下乳酸乳球菌可以忍受细胞质中高浓度的脯氨酸[18],但是又通过外排作用来控制脯氨酸的平衡,以利于为自身提供合适的生长环境。

2.3 有氧呼吸作用与血红素代谢

2.3.1 血红素的摄取 乳酸乳球菌进行有氧呼吸代谢时涉及血红素摄取、运输以及插入到bd型细胞色素氧化酶3个过程[19]。乳酸乳球菌不具备血红素合成的能力,因此,乳酸菌应该具有从外源摄取血红素的系统。在乳酸乳球菌摄取血红素的酶系是由fbuDBAR操纵子编码的[12]。

2.3.2 血红素的结合 血红素插入到细胞色素氧化酶时可能涉及到伴娘蛋白,但是这一类蛋白质在乳酸菌中还没有被充分证实。烷基过氧化氢还原酶(alkyl hydroperoxide reductase,AhpC)可能是血红素的伴娘蛋白,AhpC是对氧胁迫的应答蛋白,可以保护细胞内的血红素避免降解[20]。cydC和cydD基因编码的复合物也可能是血红素的伴娘蛋白,cydC和cydD基因编码的复合物的主要功能是用来组装细胞色素氧化酶。cydC和cydD基因编码的复合物可以通过转运半胱氨酸和谷胱甘肽造成细胞内的还原环境,这种环境有利于cydA和cydB基因编码的复合物和血红素的结合[21]。

2.3.3 血红素的调节 尽管血红素对有氧呼吸代谢和很多酶反应是至关重要的,但是当血红素以游离的形式存在于细胞中的时候对细胞是有毒害作用的[22]。血红素的体内平衡系统可以避免血红素的毒害作用。乳酸乳球菌缺乏降解血红素、释放铁离子的酶系。但是,乳酸乳球菌编码了一个血红素外向流出的系统HrtRBA(过去称为YgfCBA)[23],这个系统可以向外流出多余的血红素,避免血红素在细胞内过量积累,产生毒害作用。另一个控制细胞内血红素含量的方式就是把它降解。对血红素有降解作用的酶主要包括血红素氧化酶和去亚铁离子酶。乳酸乳球菌中不存在血红素氧化酶。去亚铁离子酶可以在不破坏原卟啉环的基础上将铁从原卟啉环中释放出来。

2.4 有氧呼吸作用和甲基萘醌代谢

无论乳酸乳球菌选择哪种能量代谢模式(发酵代谢或者有氧呼吸代谢),总的甲基萘醌的产量几乎是一致的。然而,不同链长的甲基萘醌的产量是根据生长条件而改变的。在生长后期,氧分压较低,短链甲基萘醌大量积累。

2.5 有氧呼吸作用与氧气的消耗

2.6 有氧呼吸作用与能量代谢

乳酸乳球菌进行发酵代谢时需要通过F0F1ATP合成酶迸出质子以避免细胞内形成过酸的环境而利于生长,乳酸乳球菌通过有氧呼吸作用或许能够更高效的产生能量,即便这一说法尚未充分证实,但是至少能量无需用来通过F0F1ATP合成酶迸出质子,有氧呼吸链就可以在没有能量消耗的情况下将质子排除至胞外[28]。F0F1ATP合成酶的“角色”还会发生反转,可以重新收回有氧呼吸迸出的质子。另外,在生成乙酸的过程中伴随着ATP的释放。

3 乳酸乳球菌有氧呼吸代谢的实际应用

乳酸乳球菌可以进行有氧呼吸代谢在实际和商业的应用中仍然处于发展阶段,表1列出了这项技术的主要应用情况。

表1 乳酸乳球菌有氧呼吸作用的实际和潜在应用[29]

Table 1 Real and potential applications forL.lactisrespiration[29]

应用领域有氧呼吸作用的益处发酵剂提高活菌数、延长存活性食品产业双乙酰和乙偶姻的产量较高可以增强风味生物技术较低的环境胁迫利于提高蛋白质的产量血红素诱导的转运和表达系统健康与饮食通过某些乳酸菌产生维生素K2血红素在肠道中被利用而减少其毒害作用培养更“强壮”及存活性长的益生菌植物生长作为植物信号分子的乙偶姻可以促进植物生长

3.1 发酵剂

从工业的角度来讲,活菌数量是衡量发酵剂性能的主要指标,因此,活菌数量的增加是非常重要的。相比于厌氧发酵,乳酸乳球菌利用有氧增殖可以使单位的乳酸乳球菌的数量提高102～104倍,一定程度地减少了发酵剂的生产成本。进行有氧代谢的乳酸菌的长期存活能力是发酵代谢的106～108倍,能够延长发酵剂的货架期,提高生产效益[30]。有氧呼吸作用还可以减少氧化损伤以及酸胁迫,这2个重要的因素可以提高工业生产的效率。在标准的乳制品工业生产条件下,乳酸乳球菌通过有氧呼吸代谢和发酵代谢生产出的发酵剂分别用来制作干酪,结果2种发酵剂生产出来的干酪在感官、水分含量、可溶性氮的总量以及2个月后的pH都毫无区别[31]。这说明有氧呼吸技术可以用来工业化生产发酵剂。丹麦、美国、英国、法国都已经应用该技术生产出来的发酵剂生产干酪,包括切达干酪、菲达干酪、松软干酪。2004年,全球有接近100000吨的干酪是通过有氧呼吸技术生产出来的发酵剂制作的[32]。2005年,法国农业科学院联合科汉森公司申请了有氧呼吸技术生产发酵剂的方法专利[33]。2008年,科汉森公司,花巨资4千万欧元建立了一个可以通过有氧呼吸代谢生产发酵剂的工厂,并且实现了产量的最大化,这也体现了这项技术具有长期发展的可能[34]。

3.2 食品产业

虽然乳酸乳球菌有氧呼吸技术具有诱人的前景,但是目前这项技术还没有应用到食品领域,食品领域面临着诸多的限制因素,从食品安全到特定人群的需求。卟啉及其衍生物已经通过洁食认证,双乙酰和乙偶姻可以作为很多食品的天然风味物质,如黄油、饼干、爆米花等。有氧呼吸代谢作用已经被证明可以提高这2种类型的挥发性产物,从而生产天然的具有芳香味的食品[35]。

3.3 生物技术

因为细菌可以生长在相对便宜、简单的培养基中,并且蛋白质的纯化较为简单,所以细菌是生产蛋白质的优良载体。然而,乳酸乳球菌却很少用来生产蛋白质,一个很重要的原因就是培养基中酸的大量积累,使某些蛋白质变性。如果可以避免这一点,乳酸乳酸菌将是生产蛋白质很好的选择,因为乳酸菌在安全方面比较可靠的而且可以分泌较小的蛋白质。目前,相比于传统发酵条件下,乳酸菌通过有氧呼吸技术可以弱化酸性环境,避免上述问题,但是乳酸乳球菌有氧呼吸还没能提高蛋白质的产量[36-37]。进一步的发展可能需要优化蛋白表达的条件和开发适当的基因工具。

3.4 健康与饮食

目前,益生菌被广泛研究并且已投入到商业产品中,乳酸乳球菌具有益生菌的潜质。含有充分的天然维生素可以提高发酵食品的健康价值。乳酸乳球菌产生的甲基萘醌可以作为宿主体内的维生素K2的来源[38]。维生素K2的最突出的作用就是有利于骨骼健康,另外还可以降低心血管疾病发病的风险[39]。很多科学研究者一直致力于如何提高乳酸乳球菌的维生素K2产量[40]。血红素在食物中普遍存在的,过量的血红素可能是对人体有毒害作用的。血红素被乳酸乳球菌摄取和利用会一定程度的减少肠道中游离的血红素。

3.5 植物健康

细菌可以向植物供给挥发性的化合物,如乙偶姻。乙偶姻可以促进植物生长[41]。在很多豆科植物中存在可以释放大量豆血红蛋白的根瘤,豆血红蛋白中富含血红素,血红素是乳酸乳球菌进行有氧呼吸的重要激活剂,乳酸乳球菌在进行有氧呼吸的过程中可以产生大量的乙偶姻和双乙酰[35]。当乳酸乳球菌定植于豆科植物的根瘤中便可以转变成有氧呼吸代谢模式,进而产生的乙偶姻可以作为信号代谢通路的一部分,加速植物的生长。乳酸乳球菌作为植物生长益生菌制剂,可以通过喷洒到植物上以促进生长。尽管这种新的使用方式需要进一步的研究,但是这个尝试已经为乳酸乳球菌有氧呼吸代谢提供了更加新颖、广泛的用途。

4 展望

总之,乳酸乳球菌在添加外源血红素的时候,可以进行有氧呼吸代谢,并且可以增加菌体总量,延长存活率,降低酸和氧的胁迫作用。通过生理实验与高通量技术相结合的办法对能和不能进行有氧呼吸的乳酸乳球菌的代谢产物、呼吸链相关基因相似性、基因表达等方面的比较将是未来研究的热点,进而获知乳酸乳球菌有氧呼吸的条件及ATP的合成机制,为乳酸乳球菌有氧呼吸代谢的工业化应用提供理论依据,并将这一理论延伸到其他乳酸菌中,应用到工业生产发酵剂中,消除氧气对乳酸菌造成的损伤,提高发酵剂的产量和生产效率,进一步提高乳酸乳球菌的经济价值。

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Impact of aerobic respiration on metabolic pathway ofLactococcuslactisand the prospect of potential application

LI Bai-liang,LIU Fei,YU Shang-fu,DU Jin-cheng,JIN Da, MENG Yue-yue,LI Na,YAN Fen-fen,HUO Gui-cheng*

(Northeast Agriculture University,Key Laboratory of Dairy Science,Ministry of Education,Harbin 150030,China)

Asafacultativeanaerobe,Lactococcus lactishasadoublemetaboliclife,itcouldgrowviaatraditionalfermentationmetabolismunderanaerobicconditions,itsrespirationcouldbeactivatedwhenprovidedwithhemeandaerobicenvironment.Here,thegeneticsrequirements,thedramaticphysiologychanges,theactualandpotentialapplicationofrespirationmetabolisminL. lactiswerediscussed.InL. lactis,bacterialbiomass,long-termsurvival,andresistancetooxygenandacidwereimpactspositivelyandsignificantlybyrespiration,whichhadgreatpotential.WithfurtherresearchofaerobicrespirationmetabolisminL. lactis,newperspectivesonunderstandingL. lactislifestyleandexploitingitsfullpotentialcanbeopened.

Lactococcus lactis;aerobicrespiration;heme;geneticbasis;physiologicalchanges

2015-08-31

霍贵成(1958-),男,博士,教授,研究方向:食品微生物与生物技术,E-mail:guichenghuo@126.com。

*通讯作者:李柏良(1989-),男,博士研究生,研究方向:食品科学,E-mail:15846092362@163.com。

国家自然科学基金(31401512);农业部公益性行业(农业)科研专项，青藏高原特色有机畜产品生产技术与产业模式(201203009)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)19-0372-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.19.064