小柴胡汤逆转人肝癌细胞BEL-7402/5-FU的多药耐药作用*

赵锦燕　刘丽雅　张毓宸　冯健愉　曾建伟　洪振丰#

（1福建中医药大学中西医结合研究院福州　350122；2福建省老年性疾病重点实验室福州　350122）

小柴胡汤逆转人肝癌细胞BEL-7402/5-FU的多药耐药作用*

赵锦燕1,2刘丽雅1,2张毓宸1,2冯健愉1,2曾建伟1,2洪振丰1,2#

（1福建中医药大学中西医结合研究院福州350122；2福建省老年性疾病重点实验室福州350122）

目的：研究小柴胡汤对BEL-7402/5-FU细胞多药耐药的逆转作用，并初步探讨其作用机制。方法：采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测不同化疗药物以及小柴胡汤对BEL-7402/5-FU细胞的半数抑制浓度（IC50），计算耐药指数和小柴胡汤的逆转倍数；流式细胞仪检测细胞内阿霉素的荧光强度；RT-PCR检测mdr1基因表达；western blot检测p-gp蛋白表达。结果：BEL-7402/5-FU耐药株对5-FU和阿霉素顺铂均具有耐药性，耐药指数分别是6 501.99和31.73；0.5 mg/ml小柴胡汤和5-FU、阿霉素联合应用，其逆转倍数分别是1.66、1.50；1.0 mg/ml小柴胡汤和5-FU、阿霉素联合应用，其逆转倍数分别是3.44、5.58；小柴胡汤增强阿霉素的荧光强度；小柴胡汤降低mdr1基因表达和p-gp蛋白表达，各个浓度均具有统计学意义。结论：小柴胡汤可以抑制mdr1基因编码蛋白产物p-gp的表达，增加细胞内化疗药物的浓度，从而逆转了肝癌细胞的多药耐药性。

肝癌；小柴胡汤；多药耐药；逆转

肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC）是世界上常见的恶性肿瘤之一，其发病率位居癌症中的第6位，死亡率位居第3位[1]。在我国，因肝癌死亡的人数每年约11万，几乎占全世界肝癌死亡人数的45%[2]。化疗是肝癌治疗的一个重要手段，尽管临床上不断推出新的抗癌药物及化疗方案，但疗效却不尽如人意。导致这一现象的主要原因是肝癌细胞对化疗药物产生了耐药性，即多药耐药（Multidrug Resistance，MDR）。中医药作为我国国粹，因其具有“高效、低毒、多靶点”等特性，被广泛应用于各种肿瘤的治疗。大量的临床资料表明，化疗配合中药治疗肿瘤比单纯化疗或中药治疗具有更好的疗效和更低的不良反应。从天然药物中寻找具有高效低毒的逆转剂成为提高化疗疗效的关键，也是目前研究的热点之一[3～4]。大量研究表明，小柴胡汤及其加减方被广泛用于防治多种恶性肿瘤[5～7]。本研究以人肝癌多药耐药细胞株BEL-7402/5-FU为研究对象，旨在探讨小柴胡汤对肝癌细胞多药耐药的逆转作用及其可能的作用机制。现报告如下：

1　材料与方法

1.1实验材料细胞株：人肝癌细胞株BEL-7402及人肝癌耐药细胞株BEL-7402/5-FU均购自南京凯基生物技术公司。药物：柴胡、黄芩、人参、半夏、甘草、大枣、生姜购自福建省同春药业股份有限公司。参考2010版《中国药典》完成小柴胡汤药物配制。柴胡、黄芩、人参、甘草及大枣加水煎煮2次，每次1.5 h，合并煎液，滤过，滤液浓缩至适量；半夏、生姜用100 ml 70%乙醇浸泡24 h，收集提取液，回收乙醇，与上述浓缩液合并，浓缩至相对密度为1.08～1.10（60℃）的药液，喷雾干燥，制成干浸膏粉，备用。主要试剂：胎牛血清（批号：10099-141）、胰酶（批号：1391607）和RPMI-1640培养液（批号：C11875500CP）购自Life公司；MTT购自美国AMRESCO公司（货号：0793）；Trizol（批号：9109）和逆转录试剂盒（批号：DRR037A）购自TaKaRa公司；阿霉素（ADM）购自美国sigma公司（批号：D1515）；p-gp抗体购自博奥森公司（批号：BS-0563R）。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养人肝癌细胞株BEL-7402培养于RPMI1640培养液，内含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素，置37℃、饱和湿度的CO2培养箱中培养；人肝癌细胞BEL-7402/5-FU除上述培养条件外，还需在培养液中加入终浓度20 μg/ml 5-FU以维持细胞的耐药性。

1.2.2两株细胞对化疗药物的敏感性检测取指数生长期的BEL-7402细胞和BEL-7402/5-FU细胞胰酶消化后，按1×105个/ml的密度接种于96孔板，培养24 h，分别用5-FU和ADM干预，每个浓度设8个复孔，并设空白对照组。继续培养48 h后，弃上清，加入5 mg/ml的MTT溶液20 μl继续培养4 h后，弃去上清，每孔加入100 μl DMSO，震荡溶解沉淀，酶标仪在波长570 nm下读取吸光度值，通过SPSS11.5软件计算各种化疗药物对BEL-7402细胞和BEL-7402/5-FU细胞的50%抑制率的剂量（IC50），计算耐药指数（RI）。RI=IC50（BEL-7402/5-FU）/IC50（BEL-7402）。

1.2.3小柴胡汤逆转耐药情况上述同样方法接种细胞，培养24 h后，0.5 mg/ml和1.0 mg/ml小柴胡汤分别和不同的化疗药物联合应用，干预48 h后，用MTT法测定各组OD值，计算IC50和逆转倍数（Reversal Fold）［RF=IC50化疗药物/IC50（化疗药物+小柴胡汤）×100%］；相对逆转率（Relative ReversalRate，RRR）=[（IC50化疗药in BEL-7402/5-FU－IC50化疗药+XCHTin BEL-7402/5-FU）/（IC50化疗药in BEL-7402/5-FUIC50化疗药inBEL-7402）]×100%。

1.2.4细胞内阿霉素的蓄积BEL-7402/5-FU细胞经接种和小柴胡汤干预48 h后，重新消化、离心、细胞计数后，调整细胞浓度至1×106/ml，取1 ml加入1 mg/ml的阿霉素5 μl，在37℃孵育10 min后离心（1 000 rpm，3 min），除去培养基，再用新鲜培养基洗去细胞外的染料；用1 ml新鲜RPIM1640培养基重悬，在37℃培养箱中孵育30 min；离心，弃上清，用预冷的PBS清洗3遍后，以流式细胞仪（FACS）用488 nm激发光检测10 000个细胞内的荧光强度，计算荧光强度平均值。

1.2.5RT-PCR检测mdr1 mRNA的表达按上述方法接种细胞，干预48 h后，Trizol法提取细胞中总RNA。以管家基因GAPDH为对照，引物序列利用Primer 5.0软件进行设计，扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，结果用Bio-Rad凝胶成像分析系统进行电泳条带分析，引物序列及扩增产物片段长度：mdr1（228bp）F：5’-CAA GCA CTG AAA GAT AAG AAA GAA-3’；R：5’-GAA ACA TCC AGC ATA GGA AAA ATA-3’。

1.2.6western blot检测p-gp蛋白的表达实验分组及处理方法同前。各组收集细胞后，使用含有PMSF的Western和IP裂解液500 μl裂解细胞，10 000×g高速离心10 min，收集上清后BCA法进行蛋白定量。各组样本取50 μg蛋白加入上样缓冲液后100℃变性5 min。SDS-PAGE上样电泳，条件：浓缩胶电压80 V，分离胶100 V。电泳完后进行转膜：100 V条件下45 min将蛋白转移至PVDF膜上。常温封闭120 min后一抗4℃孵育过夜。然后将PVDF膜用TBS-T（0.05%tween-20）漂洗3次×10 min，常温二抗孵育1 h，再次用TBS-T漂洗3次× 10 min。使用BeyoECL Plus化学发光试剂处理PVDF膜，于化学发光成像系统ChemiDocXRS+下成像。

1.3统计学处理所有数据均采用SPSS11.5统计学软件进行统计学处理，数据结果用均数±标准差（±s）表示，多组间样本的均数比较采用单因素方差分析。P＜0.05为具有显著性差异。

2　结果

2.1MTT法检测药物的敏感性MTT法检测抗癌药物对两组细胞的细胞毒作用，对5-FU和ADM这2种化疗药物，BEL-7402组的IC50分别为：275.3和1.97 μM；BEL-7402/5-FU组细胞较亲本细胞显示出耐药性，其IC50分别为：1.79×106和62.5 μM，其RI分别为：6501.99、31.73。通过结果分析可见BEL-7402/5-FU细胞除对5-FU有很高的耐药性外，对ADM也出现交叉耐药，即产生了多药耐药性。见表1。

表1　两组细胞对不同化疗药物敏感性实验结果

2.2小柴胡汤对BEL-7402/5-FU细胞耐药性的逆转效应0.5 mg/ml和1.0 mg/ml小柴胡汤与化疗药物（5-FU和ADM）联合应用48 h后，其RF分别是1.66，1.50和3.44，5.58，相对逆转率分别是39.88，34.11%和71.34，84.51%。

表2　小柴胡汤对BEL-7402/5-FU细胞的逆转效果

2.3小柴胡汤对ADM在细胞内蓄积的影响肝癌耐药细胞BEL-7402/5-FU经不同浓度小柴胡汤干预后，细胞内ADM荧光强度逐渐增强，呈剂量依赖。见图1。

图1　流式细胞仪检测ADM在BEL-7402/5-FU细胞内的蓄积

2.4小柴胡汤对mdr1mRNA和p-gp蛋白表达的影响RT-PCR结果显示，肝癌耐药细胞BEL-7402/5-FU的mdr1表达较BEL-7402细胞明显上调，小柴胡汤干预后，mdr1表达下调，呈剂量依赖；western blot结果显示p-gp蛋白表达与mRNA表达趋势一致。见图2。

图2　小柴胡汤对mdr1和p-gp表达的影响。A：RT-PCR检测mdr1的mRNA表达；B：western blot检测p-gp蛋白表达。

3　讨论

化疗是中晚期肝癌治疗的重要手段，但肝癌化疗的多药耐药现象，严重阻碍了化疗药物的作用[8]，影响患者的生存期。肝癌化疗最重要的耐药原因是mdr基因产物p-gp的过度表达[9]。p-gp是ATP依赖的跨膜糖蛋白，可将阿霉素等多种药物排至细胞外，降低细胞内药物的积聚，产生耐药性[10]。寻找高效低毒的MDR逆转剂是国内外学者研究的热点[11]，在这方面中草药有着很大的优势，小柴胡汤作为治疗少阳病的经典方，广泛用于各种肝脏疾病的治疗。前期研究发现小柴胡汤对肝癌有疗效，但是具体作用的分子机制，尤其有无逆转多药耐药的作用，尚有待进一步的研究。

小柴胡汤是由柴胡、黄芩、人参、半夏、甘草、大枣、生姜7味药组成，是治疗少阳病证的主方，被誉为“少阳机枢之剂，和解表里之总方”，功能疏肝利胆、健脾和胃、降上逆之相火，契合肝癌病机。中医药传统将小柴胡汤用于具有少阳病证候的发热、恶心呕吐、头晕目眩、黄疸、疟疾等。现代临床研究发现小柴胡汤对于防治食管癌、肺癌、大肠癌、乳腺癌和肝癌均有显著疗效[5,12～15]。

本研究应用构建成功的肝癌耐药细胞株BEL-7402/5-FU和亲本BEL-7402细胞观察小柴胡汤的逆转作用。实验结果发现，与BEL-7402细胞相比，耐药株BEL-7402/5-FU具有更高的耐药指数，小柴胡汤联合化疗药物应用后有部分逆转作用。进一步研究结果表明，小柴胡汤能够增加化疗药阿霉素在BEL-7402/5-FU细胞内的蓄积，降低mdr1基因和p-gp蛋白的表达，提示小柴胡汤具有逆转肝癌多药耐药的作用，可能是通过降低多药耐药蛋白p-gp的表达而实现的。至于其具体的逆转能力及作用机制，我们将做进一步的探讨。

[1]Levin B,Amos C.Therapy of unresctable hepatocellular carcinoma[J]. N Engl J Med,1995,332(19):1294-1296

[2]孙燕.内科肿瘤学[M].北京:人民卫生出版社,2001.574-575

[3]蒋吉英,丁洁,李进,等.肝癌多药耐药中药逆转剂的研究进展[J].现代肿瘤医学,2009,17(5):962-964

[4]夏薇,秦忠芳,朱广荣.一种有效的肿瘤耐药逆转剂-汉防己甲素逆转白血病耐药的实验研究[J].南京医科大学学报,1995,15(3): 543-546

[5]金航.小柴胡汤预防肝癌的研究[J].国外医学?中医中药分册,1999,21 (1):21-23

[6]沈红梅,黄杰.加味小柴胡汤对癌症化疗患者肝功能保护作用的临床观察[J].云南中医中药杂志,2005,26(6):15-16

[7]刘应柯,宫璀璀,刘尚岭.加味小柴胡汤对顺铂诱导大鼠肝BRL细胞过氧化损伤的保护作用[J].中医研究,2006,19(12):17-18

[8]王永存,余忠华,李芸.多药耐药基因1与肝癌[J].海南医学,2011,22 (5):133-136

[9]Huesker M,Folmer Y,Schneider M,et al.Reversal of drug resistance of hepatocellular carcinoma cells by adenoviral delivery of anti-M DR1 ribozymes[J].Hepatology,2002,36(4pt1):874-884

[10]Akiyama S,Chen ZS,Kitazono M,et al.Mechanisms for resistance to anticancer agents and the reversal of the resistance[J].Hum Cell, 1999,12(3):95-102

[11]HeikeY,KasonoK,KunisakiC,etal.Overcomingmulti-drug resistance using an intracellular anti-M DR1 sFv[J].Int J Cancer, 2001,92(1):115-122

[12]梁靓靓,殷东风,周立江.小柴胡汤对Lewis肺癌小鼠VEGF表达的实验研究[J].中医药学报,2008,3(4):15-17

[13]杜好信,黄种新,姚成才.小柴胡汤对人食管癌细胞株Eca-109增殖和凋亡的影响[J].光明中医,2014,29(1):51-54

[14]鄢良春,刘青春,赵军宁,等.小柴胡汤在Caco-2细胞模型的吸收特性和转运机制研究[J].中国中药杂志,2011,36(8):1087-1090

[15]秦春华,李凤霞.小柴胡汤辅助化疗治疗晚期乳腺癌的近期疗效观察及其对肿瘤标志物的影响[J].中国医院药学杂志,2015,35 (15):1420-1438

Xiaochaihu Tang Reverses Multidrug Resistance in Resistant Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line BEL-7402/5-FU

ZHAO Jin-yan1,2,LIU Li-ya1,2,ZHANG Yu-chen1,2,FENG Jian-yu1,2,ZENG Jian-wei1,2,HONG Zhen-feng1,2#
(1Academy of Integrative Medicine,Fujian University of Traditional Chinese Medicine,Fuzhou350122; 2Fujian Key Laboratory of Integrative Medicine on Geriatrics,Fuzhou350122)

Objective:To determine the reversal effect of Xiaochaihu tang(XCHT)on the resistant human hepatocellular carcinoma cell line BEL-7402/5-FU and explore its mechanism.Methods:The IC50of BEL-7402/5-FU cells was examined by MTT and calculated the resistance index(RI)and the reversal folds(RF)of XCHT.Intracellular Adriamycin(ADM)concentration was determined by flow cytometry.RT-PCR and western blot was used to detected the expression of mdr1 and p-gp respectively.Results:BEL-7402/5-FU showed resistance to variety of chemotherapeutic drugs,the RI of 5-FU or ADM was 6 501.99 or 31.73.XCHT(0.5 mg/ml or 1.0 mg/ml)combined with 5-FU and ADM,the reversal fold was 1.66 and 1.50 or 3.44 and 5.58.XCHT increased the intracellular concentration of ADM. XCHT down-regulated the mdr1 and p-pg expression,and both had significant difference.Conclusion:XCHT can inhibit the expression of p-gp coded by mdr1 gene,and increase the intracellular concentration of chemotherapeutic drugs,so as to reverse the multidrug resistance of HCC cells.

Hepatocellular carcinoma;Xiaochaihu tang;Multi-drug resistance;Reverses

R96

B

10.13638/j.issn.1671-4040.2016.09.001

国家自然科学基金项目（编号：81303125）

洪振丰，E-mail：zfhong1953@163.com

（2016-08-14）