HPLC法测定归芍护肝颗粒中芍药苷的含量

戴 芸，胡 秀，杨 林，柯春霞

（1. 黄石市中心医院（湖北理工学院附属医院），湖北 黄石 435000； 2. 肾脏疾病发生与干预湖北省重点实验室，湖北 黄石 435000）

HPLC法测定归芍护肝颗粒中芍药苷的含量

戴 芸1，2，胡 秀1，2，杨 林1，2，柯春霞1，2

（1. 黄石市中心医院（湖北理工学院附属医院），湖北 黄石 435000； 2. 肾脏疾病发生与干预湖北省重点实验室，湖北 黄石 435000）

建立测定归芍护肝颗粒中芍药苷含量的方法。采用HPLC-UV法，Aglient ZORBAX SB-C18柱（4.6 ×250 mm，5 µm）；流动相为乙腈-0.1 %磷酸溶液（14：86，v/v）为流动相；检测波长为230 nm；柱温为30 ℃；流速为1 mL/min。芍药苷在10～100 μg/mL范围内线性关系良好，平均回收率为98.79%，RSD 分别为0.92%。该法简便、准确、灵敏、重现性好，可用于归芍护肝颗粒中芍药苷含量的测定。

HPLC；归芍护肝颗粒；芍药苷；含量测定

归芍护肝颗粒由我院经过长期的临床经验总结而来，是用于“行气解郁、活血化瘀、清利湿热”的中药颗粒剂，临床上主要用于轻度肝损伤的治疗[1,2]。该方剂由当归、白芍、山药、茯苓、泽泻等八味中药配伍，经过煎煮、浓缩、混匀等工艺制成[3]。为有效控制本品的质量，确保疗效和进一步开发利用，该研究建立方中芍药苷的含量测定方法。芍药苷为方中白芍的主要药效成分，具有补肝养肾涩精之功效。本研究参照相关文献[4,5]和前期工作基础建立归芍护肝颗粒中芍药苷的含量测定方法。

1 实验部分

1.1 药品与试剂

芍药苷（纯度：96.4%，购自中国食品药品检定研究院，批号：110736-201438）；当归、白芍、山药、茯苓、泽泻等药材购自湖北蕲州中药材市场；乙腈、甲醇（色谱纯，美国赛默飞世尔公司）；无水乙醇、磷酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；水为纯净水。

1.2 仪器

日立 L-7000型高效液相色谱系统，配有L-7110 型泵，L-7200 型自动进样器，L-7420 型UV检测器；Sigma 3K15 高速低温离心机（Sigma公司）；XW-80A 旋涡混合器（上海青浦沪西仪器厂）；KQ 250DE型数控超声波清洁器（昆山市超声仪器有限公司）；METTLER ME104E型电子天平（瑞士梅特勒公司）。

1.3 溶液制备

1.3.1 对照品溶液的制备

芍药苷对照品适量，精密称定，置100 mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，制成每l mL含 200 μg的溶液，即得，保存于4 ℃冰箱备用。

1.3.2 供试品溶液的制备

取本品中粉约0.5 g，精密称定，置50 mL容量瓶中，加稀乙醇30 mL，超声处理（功率240 W，频率45 kHz）30 min，放冷，加稀乙醇至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

1.3.3 阴性供试品溶液的制备

按处方制备不含白芍的归芍护肝颗粒10 g，取适量按1.3.2项下方法制备阴性对照溶液。

1.4 色谱条件[6,7]

色谱柱为Aglient ZORBAX SB-C18柱（4.6×250 mm，5 µm）；以乙腈-0.1 %磷酸溶液（14：86）为流动相；检测波长为230 nm；柱温为30 ℃；流速为1 mL/min，分析时间25 min。

2 结 果

2.1 专属性

取阴性供试品溶液、对照品溶液及供试品溶液，按1.4项下色谱条件进样分析，在230 nm记录供试品溶液色谱图，芍药苷保留时间为14.23 min，阴性对照品溶液无此特征峰，如图 1。表明供试品中其它组分对所测组分无干扰。

2.2 线性关系

分别取不同体积的芍药苷对照品溶液置10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度。配制成含芍药苷10、20、40、60、80、100 μg/mL的标准系列溶液。以芍药苷的峰面积比值为Y，以芍药苷的浓度为X，线性回归得到芍药苷的回归方程为

Y=4596.4X+23026，相关系数为r2=0.999 2，芍药苷对照品溶液在10～100 μg/mL浓度范围内线性关系良好。

2.3 精密度

取对照品溶液，按1.4项下色谱条件，自动重复进样 5 次，进样量 10 μL，记录色谱图。结果芍药苷峰面积RSD为0.88%，表明方法精密度良好。

2.4 重复性

取同一批号归芍护肝颗粒供试品6 份，按1.3.2项下方法分别制备供试品溶液，按1.4项下色谱条件，进样分析，进样量为10 μL。计算芍药苷的平均含量为2.36 mg/g，RSD为0.73 %，表明方法重复性良好。

图1 HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms

2.5 稳定性

取配制好的同一批号归芍护肝颗粒供试品溶液，室温下放置，分别于配制后0、3、6、9、12 h 各进样 1 次，记录色谱图，芍药苷峰面积 RSD为0.94%，表明供试品溶液在12 h内基本稳定。

2.6 加样回收率

取同一批号归芍护肝颗粒供试品约0.25 g，共6份，精密加入芍药苷对照品溶液3 mL，再精密加入27 mL稀乙醇溶液，按1.3.2 项下方法制备供试品溶液，按1.4项下色谱条件进样测定，结果显示芍药苷的平均加样回收率为98.79%，RSD 为 0.92 %。结果见表1。

2.7 供试品含量测定

取不同批号的归芍护肝颗粒供试品 3 批，按1.3.2 项下方法制备供试品溶液，按1.4项下色谱条件，进样分析，进样量为10 μL，记录峰面积，计算供试品中芍药苷的含量（mg/g）。每批供试品测定3 份，结果如表2。

表1 芍药苷的加样回收率（n=6）Table 1 Recovery of peoniflorin (n=6)

表2 芍药苷含量测定结果Table 2 Determination of peoniflorin content

3 结 论

肝损伤属中医“积聚”、“胁痛”、“黄疸”、“痞满”等范畴。治疗当疏肝健脾利湿、活血祛瘀。采用中药复方治疗肝损伤，可切中病机，标本兼治，使肝脾得调、气血畅利，能够取得良好的疗效[8]。

本研究建立了用高效液相色谱法测定护肝中药复方归芍护肝颗粒中芍药苷含量的方法，芍药苷在10～100 μg/mL范围内线性关系良好。方法精密度、重现性、稳定性和加样回收率均符合中药有效成分含量测定的要求。

本研究建立的HPLC方法简便、准确、灵敏、重现性好，适用于归芍护肝颗粒中芍药苷含量的测定，为该颗粒剂的进一步开发利用提供了重要依据。

［1］ 刘安，任秉仪，徐朝阳，等．归芍地黄汤联合PDT治疗肝肾不足型 ESMD的疗效观察[J]．中国中医眼科杂志，2013，23（3）：161-164.

［2］ 胡泰洪，丁虹，薛博瑜，等．归芍复肝煎治疗慢性乙型肝炎 30例[J]．中医研究，2007，20（12）：15-16．

［3］ 朱世敏，唐志鹏．茵陈蒿汤护肝作用研究进展[J]．上海中医药杂志，2008，42（2）：73-75．

［4］ 周蓬，宋青，马帅．HPLC法同时测定小儿豉翘清热颗粒中栀子苷、芍药苷、黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素[J]．中成药，2013，35（8）：1693-1696．

［5］ 朱冠华，顾圣莹，康雷，等．HPLC法同时测定参芍胃安颗粒中芍药苷和黄芩苷的含量[J]．中国药房，2014，25（27）：2533-2535．

［6］ 杜 蓉，张孟佑．HPLC法测定加味逍遥丸中芍药苷与甘草苷的含量[J]．中国药房，2015，26（18）：2571-2572．

［7］ 葛尔宁．RP-HPLC法测定不同煎煮方法下当归芍药汤中阿魏酸和芍药苷的含量[J]．中国实验方剂学杂志，2005，11（6）：16-18．

［8］ 谢晶日，张苏，王海强．保肝消脂冲剂治疗脂肪肝24例观察[J]．实用中医药杂志，2008，24（7）：418．

Determination of Peoniflorin Content in Guishao Hugan Granules by HPLC

DAI Yun1,2, HU Xiu1,2, YANG Lin1,2, KE Chun-xia1,2
（1. Department of Pharmacy, Huangshi Central Hospital, Affiliated Hospital of Hubei Polytechnic University, Hubei Huangshi 435000, China; 2. Hubei Key Laboratory of Kidney Disease Pathogenesis and Intervention, Hubei Huangshi 435000, China）

A method for determination of peoniflorin content in Guishao Hugan Granules was established. A HPLC-UV method was developed. The separation was performed on a ZORBAX SB-C18 column (4.6×250 mm, 5 µm). The mobile phase consisted of acetonitrile- 0.1% phosphoric acid (14:86, v/v) at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was 230 nm. The column temperature was 30 ℃. The calibration curves of peoniflorin showed good linearity in the range of 10～100 μg/mL. The average recoveries were 98.79% with RSD of 0.92%. The method is simple, accurate, sensitive and reproducible for determination of peoniflorin content in Guishao Hugan Granules.

HPLC; Guishao hugan granules; Peoniflorin; Content determination

TQ 460

A

1671-0460（2016）03-0476-03

2015-12-07

戴芸（1974-），女，湖北黄石人，主管药师，1997年毕业于中国药科大学药学专业，研究方向：从事临床药学技术工作。

柯春霞（1975-），女，主管护师，研究方向。E-mail：kechunxia@hotmail.com。