IPS细胞定向分化为造血干细胞关键技术的研究进展

2016-12-22 17:47曾宪卓陈帅王一飞舒辉萍张捷滕娇
科学与财富 2016年18期
关键词:分化

曾宪卓+陈帅+王一飞+舒辉萍+张捷+滕娇+李德智+莫建华

摘要:本文研究了诱导多能干细胞(IPS)分化为造血干细胞的能力。用小鼠骨髓基质细胞OP9与人类IPS共培养,将IPS分化为造血干细胞,用流式细胞术检测造血干细胞表面标志物的表达水平,实时荧光定量检测分化过程中IPS与造血干细胞的基因表达水平的变化,用免疫磁珠法分离CD34+造血干细胞检测细胞的集落形成能力。结果显示:IPS与OP9细胞共培养诱导造血分化第四天IPS发生了变化,分化得到造血干细胞的表面标志物CD34。分化过程中多能性标志基因Oct4表达下降,造血转录因子表达升高,CD34的表达量逐渐升高,集落培养14天后得到红系集落、粒系集落、巨核系集落等。从而得到结论通过将IPS细胞与OP9细胞共培养,可诱导IPS细胞分化为造血干细胞。

关键词:IPS细胞;分化;造血干细胞

0 引言

目前,临床上普遍使用造血干细胞移植,用于白血病、非霍奇金淋巴瘤、地中海贫血等病的治疗。造血干细胞的主要来源是脐带血、骨髓。如果直接进行骨髓移植,则需要进行人体的白细胞抗原配型,否则发生免疫排异会危及患者生命。现有脐带血库储存的造血干细胞免疫原性弱,但数量供不应求,使其在疾病中的临床应用中受到限制。随着诱导性多能干细胞(IPS)提取技术的出现,使分化自身细胞变为了现实,不但避免了伦理问题,解决了免疫排斥问题,造血干细胞的数量也能满足临床需求。下面将分化研究过程报道如下:

1 材料和方法

1.1细胞株的来源

小鼠骨髓基质细胞OP9购于美国ATCC,诱导性多能干细胞IPS由中科院广州生物医药与健康研究院提供。

1.2试剂和仪器

小鼠骨髓基质细胞OP9的培养基为α-MEM,内含20%的胎牛血清,OP9细胞诱导干细胞分化培养基为α-MEM(15%的DFBS、0.25%胰酶、0.1%明胶),CD34来自MACS公司。抗体为APS-TRA-1-85,半固体培养基购于SCT公司。流式细胞仪为美国AccuriC6型,定量PCR仪为CFX96型。

1.3方法

在六孔板中先铺好1%的metrigel进行细胞培养,每三天添加0.5mmol/L的EDTA,以保持对照组细胞的未分化状态,OP9用细胞培养液培养,培养时放在大小为10cm且铺有0.1%的明胶的盘里,,每隔四天用胰酶消化传代。细胞培养温度为37℃,CO2浓度为0.5,湿度饱和。

OP9细胞进行传代培养4天后,将OP9的培养液换成诱导干细胞分化的培养液,将UC013细胞洗两遍后,再对边缘部位细胞进行消化,将细胞吸出后加入Dispace,再用枪头吹吸混匀细胞后,将其转移到加有分化培养液的细胞盘中摇匀,在与上述培养的温度、空气CO2浓度和湿度相同的条件下进行培养,培养的第二天将培养液换为共培养液,第四天开始每隔一天半换一次培养液,第九天收样品。

免疫磁珠法分选CD34+细胞,将细胞用PBS洗两遍,接着用胰蛋白酶进行消化,制备单细胞悬液,再将细胞收集到离心管中进行离心,收集沉淀,再向其中加入2%血清吹打均匀。过滤后,向其中加入FCR和 CD34标记细胞,30秒后加入流式细胞缓冲液,再离心,然后吸取上清,加入流式细胞缓冲液重悬。将制备好的细胞悬液加入流式细胞仪进行分离,通过流式细胞仪分离柱的CD34-细胞被移出分离柱弃之,最终,通过加压洗脱分离柱上黏附的细胞,即得到CD34+细胞。

用流式细胞术进行检测,将共培养9天后的细胞用PBS清洗、胰蛋白酶消化后,制备单细胞悬液,收集到离心管中,静置五秒后,用加有2%血清的流式缓冲液重悬,细胞过滤后,加入FCR和抗体,孵育15min,再用流式缓冲液清洗,重悬,最后用流式细胞仪进行检测。

集落形成实验。将分选的CD34+细胞接种到半固体培养基中,放于培养皿中进行培养,每孔接种1万个细胞,培养14-16天。然后,在显微镜下根据集落成的血细胞形成特征,对集落细胞进行分类和计数。同时,提取共培养2、4、6、8、10和12天的细胞的RNA,用RT-PCR法检测各基因在细胞中的相对表达量。

2 结果

2.1细胞培养与观察

观察培养的细胞,结果显示,对照组未分化的人体细胞集落状生长,呈扁平状,排列紧密,没有分化的迹象。实验组培养2天后的细胞,表面布满细胞集落,已进行造血干细胞分化。OP9细胞贴着细胞壁生长,细胞为三角形,周围向外出伸出像纤维状的伪足,细胞排列规则,生长迅速,培养4天后细胞铺满了培养皿底。

2.2诱导造血干细胞分化

通过在本实验组的诱导分化条件下,对实验组和对照组细胞的培养,实验组细胞分化到一定程度后,便开始大量克隆,细胞的形态也发生了分化,接着,OP9细胞开始出现老化迹象。

2.3流式细胞术检测

共培养9天后用流式细胞仪检测细胞造血表面标志物表达情况,用流式细胞仪分析培养细胞的CD34、CD43、CD31的表达情况,结果显示表达上述表面标志物的细胞分别占有比例为20%、2%和7.1%。

2.4 4RT-PCR检测

运用RT-PCR对共培养的细胞进行基因表达检测,结果显示,IPS细胞发生造血分化时,Oct-4基因的表达慢慢消失;造血转录因子基因表达缓慢升高;Runx-1基因在造血干细胞分化12天当中的表达呈波浪式变化,其中分化第二天表达量最高,第四天开始下降,第八天开始升高;CD34在造血分化过程中的基因表达量逐渐增高。

2.5 CD34+细胞集落实验

CD34+细胞在半固体培养基中进行培养,根据造血干细胞的形态特征,对细胞集落进行分类和计数。结果显示,红系集落(CFU-E)、粒系集落(CFU-G)、巨核系集落(CFU-M)、粒—巨核系集落(CFU-GM)集落数量持续升高,混合系集落(CFU-GEMM)的集落数量逐渐降至最低。

3 讨论

随着干细胞技术的发展,通过诱导分化得到造血干细胞已经成为事实。相对于多能干细胞而言,IPS通过导入转录因子以及重编程进行定向分化的比例较低,,但是IPS的获得方法比较简单稳定,避免了胚胎干细胞面临的伦理和法律等问题,使IPS可以应用于细胞替代性治疗,并可以进行疾病的机理研究和肿瘤治疗药物的筛选。IPS细胞分化得到的造血干细胞免疫原性较低,解决了移植排斥的问题。

在本文的研究中,没有外加细胞因子,直接将IPS细胞诱导分化为造血干细胞,结果获得了20%的CD34+细胞,即造血干细胞,CD34是表达于造血干细胞的表面标志物,表明IPS可以分化为造血干细胞,但是转化率比较低。Runx1是调控造血干细胞分化的转录因子,期基因的表达量在分化过程中呈现波浪式的变化,Gata-2的表达则逐渐升高。体外分化得到的造血干细胞在半固体培养基中成集落状态,说明IPS可以向各细胞系进行分化。

现在多能干细胞分化为造血干细胞的方法主要有:一是形成胚状体后再进行诱导生成造血干细胞;二是基质细胞与多能干细胞共培养;三是形成EB后与OP9进行共培养;四是单层诱导ESC生成造血干细胞。利用OP9细胞与胚胎干细胞共培养,可以模拟体内的造血微环境,为研究细胞定向分化为造血干细胞创造了可能性,OP9细胞主要支持早期的造血干细胞分化,并协助B淋巴细胞增殖。基质细胞通过释放的细胞因子支持造血干细胞的分化。这种诱导方法分化时间短,为临床造血干细胞的移植提供了便利。诱导分化过程中不用添加细胞因子,比较经济。但该诱导方法也存在着一定的缺点,即存在鼠源性污染细胞的可能性,加之所用血清的成分的不明确性,限制了其在临床应用。

目前临床上移植造血干细胞主要是用脐血和骨髓来源的造血干细胞,而体外分化和扩增得到造血干细胞只能通过动物试验来获得。将造血干细胞植入重建小鼠体内,可以评价造血干细胞的功能。体外分化获得的造血干细胞和脐血中的造血干细胞与重建小鼠体内造血系统差异较大,需要进一步优化体外诱导多能干细胞分化为造血干细胞的过程,才能满足该实验需求

4 小结

通过将IPS定向分化为造血干细胞的研究,成功诱导了造血干细胞,分化得到的细胞在体外培养中形成了所需的各系集落,本文的研究所采用的技术方法希望可以为IPS细胞在造血疾病中的应用提供一定的实验依据。

参考文献:

[1]张坤等.体外诱导人类诱导性多能干细胞分化为造血干/祖细胞的研究,中国实验血液杂志,2014.01.

[2]章忠明.自体造血干细胞移植治疗B细胞非霍奇金淋巴瘤的研究进展,实用肿瘤杂志,2013.04.

[3]杨晟.凋亡通路分子标志在T细胞淋巴瘤中的遗传变异和蛋白表达,中国协和医院大学,2007.

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