山苓祛斑凝胶剂提取物质量标准研究

陈军++舒祥++余南才

【摘要】目的：建立山苓祛斑凝胶的质量标准。方法：运用HPLC法测定祛斑凝胶提取物中尿囊素、阿魏酸含量作为评价指标，流动相分别为乙腈-0085%磷酸-水（5∶95）、（17∶83），流速为05mL/min、1mL/min，柱温30℃，检测波长为224nm、316nm。结果：尿囊素、阿魏酸线性范围0368～2208μg、0424～2544μg，精密度RSD 055%、092%，稳定性RSD 14%、15%，重复性RSD 095%、055%。祛斑凝胶剂中尿囊素、阿魏酸含量分别为112mg/g、45mg/g。结论：该方法重复性好，质量可控，可为该凝胶制剂进行中试、生产提供参考。

【关键词】山苓祛斑凝胶；含量测定；高效液相色谱法

【中图分类号】R2841【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2016）21-0011-03

黄褐斑也称“肝斑”、“蝴蝶斑”，为面部黄褐色色素沉着，且多对称蝶形分布于颊部，大小不一、形态不定，好发于育龄期女性[1]。黄褐斑由多种因素综合作用导致，其发病与妊娠、长期口服避孕药、月经紊乱有关，血中雌激素水平高是主要原因。目前，尚无彻底治愈方法，临床治疗方法有一定的副作用，如造成外源性褐黄病、皮肤萎缩、永久性脱色，甚至出现肾毒性、精神、神经症状等，因而黄褐斑一直是医学界关注的问题。中医药治疗黄褐斑有着悠久历史，具有一定优势。中药凝胶剂是一种新型外用制剂，适用于皮肤、黏膜及腔道，不仅避免口服给药存在的胃肠道内酶、酸等首过作用，而且可减轻药物不良反应，同时具有使用方便、舒适、生物相容性好等多种优点，临床上治疗黄褐斑已取得较好疗效[2-4]。复方中药山苓祛斑方为我院中医部周利副主任医师经验方，由山药、茯苓、白芷、白及、当归等药组成。研究以尿囊素、阿魏酸含量作为凝胶剂质量标准[5-6]，用HPLC法测定凝胶剂中尿囊素、阿魏酸含量，为其质量控制提供实验依据。

1仪器与材料

1.1仪器DIONEX Ultimate 3000 型高效液相色谱仪（紫外DAD检测器，美国DIONEX公司）；CP 2104 电子天平（奥豪斯仪器（上海）有限公司）。

1.2材料山药、茯苓、当归等9味中药材饮片（亳州国一堂中药饮片有限公司），祛斑凝胶剂（批号：20150401、20150405、20150410，自制）；凝胶剂阴性样品（自制不含当归及山药的样品各一份，批号20150410），尿囊素（批号：111501-200001）、阿魏酸对照品（批号：110773-200611）、茯苓（批号：121117-201302）、当归（批号：120927-201408）、山药（批号：121137-201405）等对照药材购于中检所，乙腈为色谱纯，其余试剂为分析纯。

2方法

2.1祛斑凝胶提取物中尿囊素含量测定

2.1.1色谱条件ODS C18色谱柱（Thermo-Scientific Syncronis， 250mm×4.6mm，5μm）；流动相：乙腈-0.085%磷酸水（5∶95）；流速：0.5mL/min；柱温：30℃；检测波长：224nm；进样量：10μL。

2.1.2对照品溶液制备精密称取尿囊素对照品9.2mg，置50mL量瓶中，用超纯水稀释至刻度。

2.1.3供试品溶液制备称取山苓祛斑凝胶提取物3g，加入适量甲醇超声溶解，加入100-200目硅胶4.5g，蒸干溶剂后进行硅胶柱色谱分离。硅胶用量为50g （300～400目），洗脱剂选择二氯甲烷∶甲醇（9∶1），收集200mL，浓缩后用甲醇稀释至10mL，作为供试品溶液。

2.1.4阴性对照溶液制备按处方量制备除山药外的所有组分的凝胶剂，作为山药阴性对照样品，余同“2.1.3”操作，即得。

2.1.5线性关系考察分别进样2、4、6、8、10、12μL以尿囊素含量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，进行线性回归，得回归方程y=9.0814x+0.0354，R2=0.9998，表明尿囊素在0.368～2.208μg线性关系良好。

2.1.6精密度试验精密吸取供试品溶液10μL，连续进样6次，记录峰面积积分值，结果表明：精密度良好，平均峰面积为15.5925，RSD为0.55%。

2.1.7稳定性试验精密吸取尿囊素标准品溶液10μL，按0、4h、8h、12h、16h、24h 进样1次，记录峰面积积分值，结果表明：尿囊素标准品稳定性良好，RSD为1.4%。

2.1.8重复性试验取同一批凝胶剂6份，按尿囊素供试品制备方法制备供试品溶液，按“2.1.1”色谱条件进样6次，计算尿囊素平均含量为4.5mg/g，RSD为0.95%，表明该方法重复性良好。

2.1.9加样回收率试验称取山苓祛斑凝胶提取物1.5g，分别加入尿囊素对照品溶液15μL，按照供试品溶液制备的方法处理，进样10μL，记录峰面积积分值，代入回归方程，计算尿囊素标准品的加样回收率为97.2%，RSD为1.2%。

2.1.10尿囊素含量测定精密吸取供试品溶液10μL，液相色谱仪，记录峰面积积分值，代入回归方程，计算得出尿囊素含量为4.5mg/g。

2.2山苓祛斑凝胶提取物中阿魏酸含量测定

2.2.1色谱条件ODS C18色谱柱（Thermo-Scientific Syncronis， 250mm×4.6 mm，5μm）；流动相：乙腈-水（17：83）；流速：1mL/min；柱温：35℃；检测波长：316nm，进样量：10μL。

2.2.2对照品溶液的制备精密称取阿魏酸对照品，加甲醇制备成浓度为0.212μg/μL的溶液。

2.2.3供试品溶液的制备取山苓祛斑凝胶提取物10g，加甲醇超声，并定容至50mL容量瓶中。

2.2.4阴性对照溶液制备按处方量制备除当归外的所有组分的凝胶剂，作为当归阴性对照样品，余同“2.2.3”操作，即得。

2.2.5线性范围考察分别精密吸取阿魏酸对照品溶液2、4、6、8、10、12μL注入液相色谱仪，测定峰面积，以峰面积和进样量求得回归方程y=1.2937x +0.3404， R2=0. 9996，表明在0.424～2.544μg有良好线性关系。

2.2.6精密度实验精密吸取对照品溶液10μL，重复进样6次，测得峰面积，其RSD为0.92%，表明仪器精密度良好。

2.2.7稳定性试验精密吸取阿魏酸标准品溶液10μL，按0、4、8、12、16、24h 进样1次，记录峰面积积分值，结果表明：阿魏酸标准品稳定性良好，RSD为1.5%。

2.2.8重复性试验取同一批凝胶剂6份，按阿魏酸供试品制备方法制备供试品溶液，按“2.2.1”色谱条件进样6次，计算阿魏酸平均含量为11.4mg/g，RSD为0.55%，表明该方法重复性良好。

2.2.9加样回收率实验精密量取两份1mL样品溶液：向其中一份精密添加阿魏酸对照品溶液，定容至50mL，测得平均回收率为96.8%，RSD为1.56%。

2.2.10阿魏酸含量测定精密吸取供试品溶液10μL，液相色谱仪，记录峰面积积分值，代入回归方程，计算得出阿魏酸含量为11.2mg/g。

2.3山苓祛斑凝胶剂TLC定性鉴别按2015版《中国药典》一部及附录（0502）薄层色谱法对祛斑凝胶剂中山药、当归及茯苓进行TLC定性鉴别[7]，供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性无干扰。

按文献[8]对山苓祛斑凝胶剂中的尿囊素进行薄层鉴定：取山苓祛斑凝胶剂10g，加入适量甲醇超声溶解，溶解后吸取10μL点于硅胶GF254板，以氯仿∶乙酸乙酯∶丙酮∶甲酸∶甲醇（1∶8∶1∶1∶2）为展开剂，15%的对二甲氨基苯甲醛的硫酸乙醇溶液为显色剂。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同黄绿色斑点，且阴性样品无干扰。

3讨论

3.1波长选择经紫外光谱扫描，测得尿囊素在224nm处有最大吸收，阿魏酸在316nm处有最大吸收，故本文分别选择224nm作为尿囊素的检测波长，316nm作为阿魏酸的检测波长。

3.2流动相的选择原有用甲醇-水（1∶9）测定尿囊素含量，实验发现其分离效果不好，分离度不能达到分析要求；甲醇

-磷酸二氢钾缓冲液（2∶98）比例的极性太大，而纯水对色谱柱的损害较大。经摸索最后采用乙腈-0.085%磷酸-水

（5∶95） 作为流动相，基本能够达到较好的分离效果，尿囊素出峰时间大约在5.5min左右。重复性试验RSD为0.95%，加样回收试验测得平均回收率为96.8%，RSD为1.56%也表明在此色谱条件下尿囊素的分离效果较为满意。

研究通过测定山苓凝胶剂中尿囊素和阿魏酸的含量，初步确定了山苓凝胶剂的质量控制方法。所建立的方法简单，准确，分离度与重现性均好，可以用于控制山苓凝胶剂的质量。

参考文献

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（编辑：陶希睿）