苯酚对斑马鱼的抗氧化酶活性及运动行为的影响

孙中训，杜娟娟，周绍辉，李 梅，逯南南，宋武昌

苯酚对斑马鱼的抗氧化酶活性及运动行为的影响

孙中训1，杜娟娟1，周绍辉1，李 梅1，逯南南2，宋武昌2

(1.山东建筑大学市政与环境工程学院，山东 济南 250101；2.山东省城市供排水水质监测中心，山东 济南 250021)

为了考察斑马鱼对苯酚类污染物的生物反应，以斑马鱼作为模式生物，采用半静态实验法研究了苯酚对斑马鱼的急性毒性、抗氧化酶活性及运动行为的影响。结果表明：苯酚对斑马鱼的24 h、48 h、72 h、96 h的LC50分别为24.247 mg·L-1、18.548 mg·L-1、15.511 mg·L-1、13.554 mg·L-1；斑马鱼鳃中的Na+K+-ATP酶活性和肝脏中的SOD活性的变化反映出苯酚对斑马鱼的鳃和肝脏具有损伤作用，斑马鱼体内酶对苯酚污染敏感，可以将其作为苯酚污染的有效生物标志物；斑马鱼的运动行为变化与苯酚浓度及染毒时间明显相关，且呈规律性，可以通过监测斑马鱼的运动行为变化实现苯酚污染的在线预警。

斑马鱼；苯酚；急性毒性；抗氧化酶活性；运动行为；生物在线预警

苯酚是一类中等毒性的有机化学污染物，在工业生产过程中可能会随工业废水、地表径流进入水环境，进而污染水质。当苯酚进入生物体时会发生一系列生物反应[1]，并通过生物链积累对人体和水生生物产生不同程度的急性或慢性毒性效应[2-6]。研究表明，长期饮用被苯酚污染的饮用水可能会使人出现头晕、出疫、贫血等不良症状，严重时还损伤肝脏和中枢神经系统[7-8]。苯酚污染废水一旦进入水环境会对鱼类等水生生物产生毒害作用，损伤鳃、肝脏等组织器官，破坏呼吸系统、神经系统和免疫系统的正常功能，导致鱼类等水生生物窒息死亡[1]。因此，亟需深入开展以水生生物为研究对象的水质生物预警技术研究，对水质进行实时在线监测，实现对突发性苯酚污染的早期预报和及时应对。

目前，基于斑马鱼行为变化的生物在线监测技术已经广泛应用于水质安全在线监测系统，借助计算机和生物传感器等技术手段将斑马鱼行为学指标转换成相应的信息和数据[1]，实时监测水质安全。作者通过苯酚对斑马鱼的急性毒性、抗氧化酶活性、运动行为的影响，考察了苯酚对斑马鱼的毒性效应及在线预警技术对突发性苯酚污染的预警效果，针对斑马鱼运动行为变化规律进行定性、定量分析[5，9]，拟为在线监测苯酚污染提供基础数据和分析方法。

1 实验

1.1 受试生物

斑马鱼，购自国家斑马鱼资源中心，在实验室饲养驯化2周，死亡率小于5%。饲养用水为充分曝气去氯的自来水，水温为(25±1)℃，pH值为7.2～7.6，水中溶解氧为4 mg·L-1以上，光暗比为10 h∶14 h，每天投喂1次。实验前24 h停止喂食，随机选取健康活泼、个体差异不大的鱼进行实验。

1.2 药品、试剂与仪器

苯酚：用标准稀释水稀释母液得到不同浓度苯酚溶液，现用现配。标准稀释水：使用前测定其pH值、溶解氧量，保证pH值稳定在7.8左右、溶解氧量≥8 mg·L-1，否则用氢氧化钠调节pH值，用曝气处理调节溶解氧量。

蔗糖；三羟甲基氨基甲烷(Tris)；乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)；酶测定试剂盒，南京建成生物工程研究所。

UV1800型紫外可见分光光度计；TD5A-WS型高速离心机；EMax Plus型多功能酶标仪；HH-1型数显恒温水浴锅；Eppendorf(100～1 000 μL)微量移液枪。

1.3 方法

1.3.1 急性毒性实验

96 h急性毒性实验参照GB/T 13267-91《水质物质对淡水鱼(斑马鱼)急性致死毒性的测定》进行。采用静态置换法每天更新一半溶液[9-10]，保证溶液浓度不变，并记录更换前后染毒液的pH值、温度、溶解氧，周期为96 h。通过预实验确定斑马鱼最高全存活浓度和最低全致死浓度，在这2个浓度间选定6个浓度作为实验浓度梯度，分别是5 mg·L-1、10 mg·L-1、20 mg·L-1、30 mg·L-1、40 mg·L-1、50 mg·L-1，同时设空白对照组，每组设置3个平行，均随机放入10条大小相近的斑马鱼成鱼，鱼的平均体长为(3±0.2)cm。观察记录24 h、48 h、72 h、96 h死鱼数及中毒症状，并及时捞出死鱼和代谢产物。用SPSS19.0软件计算半致死浓度(LC50)和95%可信度。

1.3.2 Na+K+-ATP酶活性和SOD活性的测定

根据急性毒性实验结果确定染毒药剂的浓度梯度。以48 h半致死浓度(48 h LC50)为1个染毒单位(TU)，浓度梯度设定为染毒单位的0.01倍、0.05倍、0.1倍、0.5倍、1倍，即0.18 mg·L-1、0.9 mg·L-1、1.8 mg·L-1、9 mg·L-1、18 mg·L-1，同时设空白对照组。每组设3个平行，各放斑马鱼10条。实验水温为(25±1)℃，pH值为7.2～7.6，光暗比为10 h∶14 h，每24 h更新一半测试溶液，以维持原设计的溶液浓度及溶解氧等水质标准，实验期间不喂食。

实验开始后分别于0 h、6 h、24 h、48 h、72 h、96 h从各组随机取1条斑马鱼，迅速解剖，取其鳃、肝脏至冰冷的0.9%生理盐水中漂洗，除去血液，用滤纸拭干，准确称量鱼体的湿质量。取待测组织0.2 g，加入1.8 mL匀浆介质(pH值7.4，0.01 mol·L-1Tris-HCl，0.01 mol·L-1蔗糖，0.9%生理盐水，0.0001 mol·L-1EDTA-2Na)中，冰浴下充分研磨制成1%的组织匀浆。4 ℃、4 000 r·min-1离心15 min，取上清液于-20 ℃冷藏，为了不影响酶活性尽量避免反复冻融组织匀浆。Na+K+-ATP酶活性和SOD活性的测定参照试剂盒说明书进行。

Na+K+-ATP酶活性定义：将每小时每毫克组织蛋白中 ATP 酶分解 ATP 产生 1 μmol无机磷的量定义为一个Na+K+-ATP酶活力单位，单位为U·(mg prot)-1。

SOD活性定义：将每毫克组织蛋白在1 mL反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量定义为一个SOD酶活力单位，单位为U·mg-1。

1.3.3 斑马鱼运动行为监测

采用水质毒性在线生物监测仪(RTB，深圳水务集团)定量监测苯酚胁迫下斑马鱼的运动行为变化。测试箱(400 mm×75 mm×300 mm)内放置5条斑马鱼，前置CCD 摄像头，实时跟踪记录每条鱼的运动行为变化，如图1所示。通过运动行为解析软件计算5条鱼的运动行为参数(游动速度)[10]。

图1 斑马鱼运动行为监测装置

采用半静态式流水实验(流速1 L·h-1)研究苯酚污染水体中斑马鱼的运动行为变化。保持水温(25±1)℃，为消除容器变化对斑马鱼运动行为的影响，实验前通入曝气去氯的自来水，让鱼在其中适应24 h。尽量减少人为、噪音等非水质因素的干扰，投加染料观察测试箱内水力流态，经水泵提升水由测试箱底部进入，由下至上均匀扩散至顶端出水口。实验过程中不喂食，空白对照组和实验组不能有鱼死亡。从染毒溶液进入开始，连续监测48 h。

参照斑马鱼48 h LC50，苯酚的6个浓度梯度分别为0.18 mg·L-1、0.9 mg·L-1、1.8 mg·L-1、9 mg·L-1、18 mg·L-1、36 mg·L-1，同时设置空白对照，研究斑马鱼在不同浓度苯酚胁迫下的运动行为变化。每组数据为5条鱼的平均数据，每个浓度组设3个平行，取平均值。设置染毒溶液污染物浓度为配制时的浓度，而不是水槽中污染物的浓度。

1.4 数据处理与统计分析

实验数据采用SPSS19.0软件进行计算处理，结果以均值±标准差表示。

2 结果与讨论

2.1 急性毒性结果

实验发现，空白对照组中斑马鱼的游动、呼吸、对外界刺激反应等行为无明显变化。而在苯酚胁迫下，斑马鱼先出现呼吸急促、游动加快等现象，随后表现出呼吸放缓、静止不动、体表条纹消失等中毒症状，且苯酚浓度越大，中毒症状出现的时间越早。高浓度组(40 mg·L-1和50 mg·L-1)染毒30 min后，部分斑马鱼即表现出剧烈的异常反应，在烧杯中急速游动，上下翻滚，四处乱窜，鱼体失去平衡，摆尾摆鳍频率明显加快，4 h后即有部分斑马鱼死亡，漂浮于水面。苯酚对斑马鱼的急性毒性实验结果如表1和表2所示。

从表1可以看出，随着苯酚浓度的升高，斑马鱼的平均死亡率升高。由表2可以看出，苯酚对斑马鱼的24 h、48 h、72 h、96 h的LC50分别为24.247 mg·L-1、18.548 mg·L-1、15.511 mg·L-1、13.554 mg·L-1，24 h LC50约为96 h LC50的2倍。说明苯酚对斑马鱼的毒性作用随染毒时间延长而增强，二者呈明显的时间-效应关系。

表1 苯酚对斑马鱼的急性毒性实验结果

Tab.1 Results of acute toxicity of phenol toBrachydaniorerio

苯酚浓度mg·L-1染毒不同时间的平均死亡率/%24h48h72h96h空白对照00005006.66.6100132626205366808630869310010040931001001005096100100100

表2 苯酚对斑马鱼的24 h、48 h、72 h、96 h的LC50

Tab.2 The LC50 value(24 h,48 h,72 h,96 h) of phenol to Brachydaniorerio

2.2 苯酚对斑马鱼Na+K+-ATP酶和SOD活性的影响

2.2.1 苯酚对斑马鱼鳃Na+K+-ATP酶活性的影响(图2)

a～f，苯酚浓度(mg·L-1)：0,0.18,0.9,1.8,9,18

从图2可以看出，不同苯酚浓度下，斑马鱼鳃Na+K+-ATP酶活性随染毒时间的延长呈现先升高后降低的趋势。24 h时，除18 mg·L-1染毒组外，其余各组Na+K+-ATP酶活性均受到明显的抑制；48 h时，0.18 mg·L-1染毒组Na+K+-ATP酶活性被显著抑制，18 mg·L-1染毒组Na+K+-ATP酶活性受到显著诱导，其余各组Na+K+-ATP酶活性与对照组相比无显著差异，但活性与24 h相比有所升高；72 h时，除0.18 mg·L-1染毒组外，其余各组Na+K+-ATP酶活性均受到明显诱导，且在各浓度组中达到最大值；96 h时，各染毒组Na+K+-ATP酶活性相较于72 h时有所降低。除18 mg·L-1染毒组在整个96 h实验周期内Na+K+-ATP酶活性一直呈诱导作用外，其余各组Na+K+-ATP酶活性都首先被抑制，然后先升高后降低，并在72 h达到最大值。但是苯酚浓度不同，Na+K+-ATP酶活性变化趋势仍存在一定差异。低浓度(0.18 mg·L-1、0.9 mg·L-1)苯酚染毒6 h时，斑马鱼感知环境变化，苯酚对Na+K+-ATP酶活性产生诱导作用，与对照组相比Na+K+-ATP酶活性升高了10%、18%，呈现“毒性兴奋效应”；随着染毒时间的延长，苯酚对Na+K+-ATP酶活性诱导作用开始减弱，至24 h时出现明显抑制作用；持续染毒过程中，苯酚对Na+K+-ATP酶活性抑制作用减弱，Na+K+-ATP酶活性呈现上升趋势，72 h时Na+K+-ATP酶活性达到峰值；但随着染毒时间的继续延长，苯酚对斑马鱼机体产生不可逆的毒性损伤作用，Na+K+-ATP酶活性又开始呈现下降趋势。

2.2.2 苯酚对斑马鱼肝脏SOD活性的影响(图3)

a～f，苯酚浓度(mg·L-1)：0,0.18,0.9,1.8,9,18

从图3可以看出，斑马鱼肝脏SOD活性随苯酚染毒时间不同呈现出显著差异性。染毒初期，苯酚对SOD活性表现出诱导效应；随着染毒时间的延长，诱导作用逐渐减弱，甚至产生抑制作用。实验发现，苯酚染毒后造成斑马鱼体内酶的过氧化胁迫，短期内体内产生大量的自由基，造成活性氧防御能力的改变，SOD活性对污染物胁迫十分敏感，其活性变化可间接反映水质污染情况[11]。SOD活性与苯酚浓度、染毒时间呈明显的效应关系，苯酚浓度、染毒时间不同，斑马鱼肝脏SOD活性表现出不同程度的抑制或诱导作用。

2.3 斑马鱼的运动行为变化情况(图4)

图4 不同浓度苯酚胁迫下斑马鱼的游动速度

从图4可以看出，空白对照组(□标记)斑马鱼的游动速度在正常范围内变化，变化幅度较小；而苯酚胁迫下，斑马鱼在水箱中的位置分布与染毒前有所不同，游动速度发生明显变化，随染毒浓度和染毒时间不同，游动速度差异显著。(1)低浓度(0.18 mg·L-1、0.9 mg·L-1)苯酚胁迫下，斑马鱼游动速度呈先加快后恢复的变化趋势。斑马鱼在染毒后2 h感知污染物刺激，表现出“回避行为”，游动速度有加快趋势；染毒4～5 h后游动速度开始低于对照组；随着染毒时间的继续延长，斑马鱼游动速度逐渐减慢，染毒10 h后游动速度趋于稳定。(2)中等浓度(1.8 mg·L-1、9 mg·L-1)苯酚胁迫下，斑马鱼的游动速度较低浓度组明显减慢，达到峰值的时间缩短了1 h左右，且峰值增长率也明显升高。由此可知，苯酚浓度增大，毒性增大，对斑马鱼游动行为的抑制作用也随之增强，随染毒时间延长，其游动速度减慢，且无法恢复至正常水平。(3)高浓度(18 mg·L-1、36 mg·L-1)苯酚胁迫下，斑马鱼游动速度变化趋势与中等浓度组相似。与其它浓度组相比，高浓度组斑马鱼的游动速度变化明显，波动剧烈，且短时间染毒斑马鱼的游动速度就高于对照组，达到峰值的时间也缩短了1～2 h，高浓度苯酚染毒对斑马鱼游动速度抑制作用明显增强。

2.4 讨论

(1)正常水体中斑马鱼的游动速度保持相对稳定。研究发现，短时间苯酚胁迫下，根据苯酚浓度不同，斑马鱼在环境压力作用下，游动速度均是先加快后恢复再减慢，只是发生变化的时间和变化幅度有所差异。低浓度苯酚胁迫下，斑马鱼运动行为参数增长率较低，但是持续时间长；高浓度苯酚胁迫下，斑马鱼运动行为参数增长率较高，行为参数发生剧烈变化，持续一段时间又急剧降低。

(2)与对照组相比，苯酚浓度越大，斑马鱼的游动速度减小趋势越明显，与对照组的差值也越大，说明斑马鱼的游动速度与苯酚浓度、染毒时间都呈明显的效应关系，但是由于斑马鱼个体差异，游动速度达到的最大值与苯酚浓度没有较好的相关性。

(3)染毒后短时间内鱼的游动速度加快，此为水生生物对环境压力所表现的“回避行为”，是鱼类感知到污染物后的第一反应，其表现形式和维持时间长短受污染物的种类及浓度的影响，“回避行为”也被应用于水质监测和预警[12-13]。

(4)整个实验过程中，斑马鱼感知环境压力表现出了明显的行为调节，游动速度在1～6 h内高于对照组并达到峰值，浓度越大，达到峰值的时间越短，说明苯酚胁迫下斑马鱼游动速度比较敏感，可以选取游动速度作为在线监测苯酚污染后的行为异常指标。

3 结论

采用半静态实验法，研究了苯酚对斑马鱼的急性毒性、抗氧化酶活性及运动行为的影响。结果表明：苯酚对斑马鱼的24 h、48 h、72 h、96 h的LC50分别为24.247 mg·L-1、18.548 mg·L-1、15.511 mg·L-1、13.554 mg·L-1，苯酚对斑马鱼毒性呈明显的剂量-效应关系、时间-效应关系；苯酚胁迫下，斑马鱼鳃中的Na+K+-ATP酶活性和肝脏中的SOD活性的变化反映出苯酚对斑马鱼的鳃和肝脏具有损伤作用，酶活性与苯酚的染毒浓度和染毒时间呈一定的相关性；斑马鱼的运动行为变化与苯酚浓度及染毒时间明显相关，且呈规律性，可以通过监测斑马鱼的运动行为变化实现苯酚突发污染的在线预警。

[1] 倪芳.在线监测不同污染物对鱼类运动行为的影响[D].大连:大连理工大学,2014.

[2] 张亚辉,曹莹,周腾耀，等.我国环境中PFOS的预测无效应浓度[J].中国环境科学,2013，33(9):1670-1677.

[3] 王珂.氨氮的水环境生态学基准值验证[D].天津:南开大学,2012.

[4] 严莎.苯系物对我国典型鱼类和水生植物的毒害效应及其水质基准的研究[D].天津:南开大学,2012.

[5] 李汝.基于斑马鱼行为学的水质监测预警技术试验研究[D].济南:山东建筑大学,2015.

[6] 邢军.苯、氯苯、苯酚、4-氯酚对斑马鱼、孔雀鱼、剑尾鱼的急性毒性[J].生态环境学报,2011,20(11):1720-1724.

[7] 许小龙,王庭.城市水源地保护对策研究[J].科技情报开发与经济,2009(27):127-128.

[8] 周超,高乃云,黎雷，等.饮用水氯化消毒副产物对氯苯酚的去除研究进展[J].水处理技术,2011，37(9):1-5.

[9] 岳舜琳,潘海祥.用发光细菌监测水质突发性污染的适用性[J].给水排水，2008,34(3):28-31.

[10] 黄毅，张金松，韩小波，等．氯化镉和敌敌畏突发胁迫下斑马鱼的行为差异[J]．生态毒理学报，2012，7(6)：671-676.

[11] LI Y N,ZHOU Q X,LI F X,et al.Effects of tetrabromobisphenol A as an emerging pollutant on wheat(Triticumaestivum) at biochemical levels[J].Chemosphere,2008,74(1):119-124.

[12] GERHARDT A，BISTHOVEN L D，SOARES M A.Evidence for the stepwise stress model：GambusiaholbrookiandDaphniamagnaunder acid mine drainage and acidified reference water stress[J]．Environmental Science & Technology,2005,39(11):4150-4158.

[13] SAYEED I,PARVEZ S,PANDEY S,et al.Oxidative stress biomarkers of exposure to deltamethrin in freshwater fish,ChannapunctatusBloch[J].Ecotoxicology and Environmental Safety, 2003,56(2):295-301.

Effects of Phenol on Antioxidant Enzyme Activity and Movement Behavior of Brachydaniorerio

SUN Zhong-xun1,DU Juan-juan1,ZHOU Shao-hui1,LI Mei1,LU Nan-nan2,SONG Wu-chang2

(1.SchoolofMunicipalandEnvironmentalEngineering,ShandongJianzhuUniversity,Jinan250101,China;2.ShandongProvinceCityWaterSupplyandDrainageWaterQualityMonitoringCenter,Jinan250021,China)

To investigate the biological response ofBrachydaniorerioexposed to phenol pollutants,usingBrachydaniorerioas a model organism,the effects of phenol on acute toxicity,antioxidant enzyme activity,and movement behavior ofBrachydanioreriowere studied by a semi-static test.The results showed that,the LC50values(24 h,48 h,72 h,96 h) of phenol toBrachydanioreriowere 24.247 mg·L-1,18.548 mg·L-1,15.511 mg·L-1and 13.554 mg·L-1,respectively.The variation of Na+K+-ATPase activity and SOD activity could reflect the damage of phenol to gill and liver ofBrachydaniorerio.Enzyme inBrachydanioreriowas sensitive to phenol pollutants and could be a valid biomarker of phenol pollutants.Movement behavior changes ofBrachydanioreriocorrelated with stress concentration and time of phenol,and presented regularity.So,online monitoring technology based on the movement behavior changes ofBrachydanioreriois an effective way to realize online early warning of water quality.

Brachydaniorerio;phenol;acute toxicity;antioxidant enzyme activity;movement behavior;biological online early warning

直饮水科技惠民示范工程(2013GS370202)

2016-07-26

孙中训(1989-)，男，山东枣庄人，硕士，研究方向：给水处理技术，E-mail:sunzhongxun89@126.com；通讯作者：李梅，博士，教授，E-mail:limei@sdjzu.edu.cn。

10.3969/j.issn.1672-5425.2016.12.014

孙中训，杜娟娟，周绍辉，等.苯酚对斑马鱼的抗氧化酶活性及运动行为的影响[J].化学与生物工程，2016，33(12)：63-67.

X 832

A

1672-5425(2016)12-0063-05