2015～2016年菏泽市流行性感冒病毒分离鉴定结果分析

[摘要]目的 分析2015～2016年菏泽市流行性感冒（流感）病原学分离鉴定结果，为本市未来的流感防控工作提供科学依据。方法 采集2015年10月～2016年4月哨点医院内科门诊流感样病例（ILI）患者鼻或咽拭子标本，MDCK细胞分离培养，流感鉴定试剂分型鉴定。结果 流感毒株分离阳性率为27.89%（140/502）。新甲H1N1型、H3亚型、BY型和BV型交替出现，BV型为本年度的优势毒株型。流感病毒分离高峰期出现在次年3月份。流感发病人群无性别差异，易感人群以﹤15岁儿童为主。结论 2015～2016年流感病毒不同毒株型交替出现，BV型为本年度优势毒株型。

[关键词]流行性感冒；流感病毒；细胞培养；病毒分离

[中图分类号] R183.3 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2016）10（b）-0004-04

[Abstract]Objective To analyze the results of the pathogen isolation and identification of influenza virus in Heze City from 2015 to 2016，and provide scientific evidence for the prevention and control of influenza in the future.Methods The nose or throat swab specimen of influenza-like illness （ILI） cases were collected in sentinel hospitals from October 2015 to April 2016，MDCK cells were isolated and cultureed，and influenza viruses were identified by influenza identification reagent.Results The positive rate of influenza virus isolation was 27.89% （140/502）.The types of strains were type new A（H1N1）， type A （H3N2），type BY and BV that appeared alternately，type BV was the dominant strains.The peak of influenza virus isolation appeared in March 2016.There was no gender difference in the incidence of influenza.People aged<15 years were susceptible to influenza virus.Conclusion The different subtypes appeared alternately from 2015-2016 and type BV is the dominant strains.

[Key words]Influenza；Influenza virus；Cell culture；Virus isolation

流行性感冒，简称“流感”，是一类由流行性感冒病毒引起的急性呼吸道传染病，主要通过空气中的飞沫、人与人之间的接触或与被污染物品的接触传播。多发于冬春季节，其临床症状以急起高热（≥38.5℃）、伴咽痛或咳嗽、全身酸疼，病程可持续1周或者更长，严重者可出现肺炎、心肌炎等并发症甚或死亡现象。流感病毒可分为甲、乙、丙三型，其中甲型病毒易发生抗原变异，传染性大，传播迅速，极易发生大范围流行，甚或世界性大流行[1]，如2009年的甲型H1N1就出现了世界性的大流行[2]。其是第一个全球防控的传染病，也是我国重点防控的传染病之一。2015年10月～2016年4月为本市流感高发季节，流感网络监测实验室对哨点医院采集的流感样病例（influenza-like illness，ILI）标本进行流感病毒细胞分离鉴定，结果分析如下。

1材料与方法

1.1材料

2015年10月～2016年4月哨点医院采集发病3 d或3 d内的共502份ILI鼻或咽拭子标本。ILI病例是指发热（腋下温度≥38.5℃），伴咽痛或咳嗽之一者。每周采集20份，低温保存送至流感监测网络实验室。

1.2实验室分离鉴定

1.2.1细胞培养 MDCK细胞（由山东省疾病预防控制中心病毒所流感确证实验室提供）；DMEM培养基、胎牛血清、PBS、双抗（青霉素/庆大霉素）、TPCK胰酶、牛血清白蛋白组分Ⅴ等均购自美国Gibco公司；CO2培养箱（Thermo 美国）；流感病毒型别鉴定试剂盒由国家流感中心提供。

1.2.2病毒分离鉴定试剂及原理 24孔细胞培养板；人O型血红细胞；96孔微量血凝板；流感病毒型别鉴定试剂盒[抗原、抗血清分别包括：A（H3N2）、B-Yamagata系、B-Victoria系、A（H1N1）pdm09（新甲H1N1）]：由国家流感中心提供；浓度为：1∶10。血凝试验（hemagglutination test，HA test）原理[3]：流感病毒表面的血凝素（HA）蛋白，含有识别和结合宿主细胞表面受体的结构，能使一些特定的红细胞发生凝集现象。当红细胞与病毒按照适当的比例混合后，由于病毒的作用使红细胞发生凝集。红细胞凝集抑制试验（hemagglutination inhibition test，HI test）原理[3]：特异的抗流感病毒HA蛋白的抗血清，能抑制红细胞的凝集现象出现，即抗体与病毒结合后，可以使HA不吸附于红细胞表面的受体上。

1.2.3病毒分离及培养 按照《全国流感监测方案（2010年版）》[4]中《流感监测实验操作技术规范》的要求，将处理后的标本0.3～1.0 ml，接种于24孔细胞培养板中75%～90%单层成片生长MDCK细胞（每例样本接种3～6孔），吸附1～2 h，35℃ CO2培养箱培养3～7 d，每天观察细胞病变（cytopathogenic effects，CPE）状况，待CPE达到或者>70%，收集病毒液用1%人O型血红细胞进行HA试验，检测病毒的存在及滴度。HA≥8的病毒液行HI测定滴度及用流感签定试剂进行分型鉴定；HA<8的培养液继续盲传二代细胞培养（即将多孔的培养液混合然后再接种）。二代细胞培养液行HA仍阴性者，即为MDCK细胞病毒分离阴性。

1.3统计学分析

采用SPSS 17.0统计学软件对数据进行分析，计数资料用百分率（%）表示，采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1病毒分离鉴定的总体概况

2015年10月～2016年4月哨点医院门急诊就诊患者74 991例，其中ILI患者613例，占8.17%。共采集ILI咽拭子标本502份，其中男性322例，女性180例，男女性别比例为1.78∶1，男性多于女性；0～5岁组349例，>5～15岁组115例，>15～25岁组7例，>25～60岁组25例，>60岁组6例，其中0～5岁组构成比例最高，占69.52%。细胞分离鉴定出流感毒株140株，分离阳性率27.89%（140/502）。毒株型较为复杂，新甲H1N1型、H3亚型、BY型和BV型均有出现，就整个监测年来看BV型共分离出88株，占整个监测年度阳性数的62.86%（88/140），为本年度的优势毒株型（表1）。

2.2不同月份流感病毒的分离鉴定情况

按照月份来看，2015年10月～2016年4月7个月份中，ILI标本检测数逐月增多，10月、11月两个月份未有阳性毒株出现。12月ILI标本检测数达高峰并开始分离出阳性毒株，且阳性毒株数逐月增多，至次年3月流感阳性毒株分离率达峰值，为64.29%。到4月份检测标本数下降，分离阳性率也开始下降（图1）。

2.3不同流感病毒型别的时间分布

10月、11月未有阳性毒株检出；12月BY型开始出现，且为当月优势株；次年1月流感阳性毒株检出数大幅增加，且毒株型较为复杂，BY型、BV型、H3亚型及新甲H1N1型阳性株均有出现，新甲H1N1为该月优势毒株共检出14株，占该月检出数的56.00%；较1月份，2月份阳性毒株检出数又有增加，毒株型与1月相同，但优势株转为BV型；至3月份流感毒株阳性检出数达高峰，该月共检出阳性株54株，占全年检出数的38.57%，BV型成为强势型优势毒株，占本月检出数的87.04%；到4月份，流感毒株检出数开始下降，毒株型仍以BV型为主（图2）。

2.4流感毒株的人群分布情况

从性别上看，阳性标本中，男性标本阳性率为27.33%；女性标本阳性率为28.89%，差异无统计学意义（χ2=0.140，P=0.709）。从年龄组上看，各年龄组之间阳性率差异有统计学意义（χ2=25.321，P=0.000）。其中>5～15岁组，阳性率最高为44.35%；次高组为0～5岁组，其阳性率为24.64%。在0～5岁组，新甲H1N1型、H3亚型、BY型和BV型四种毒株型均有出现，BV型占比例最高为49例，其次为新甲H1N1型占28例；>5～15岁组，四种毒株型也均有，以BV型为优势株；>25～60岁组H3亚型与BY型各检出1例；>15～25岁组、>60岁组均未检出阳性病例（表2）。

3讨论

流感病毒在自然界中宿主分布广泛、基因组结构复杂、基因易发生突变和重配，这使流感病毒成为人类健康的重大威胁。流感病毒表面抗原HA和神经氨酸酶（neuraminidase，NA）的变异有两种形式，即抗原性漂移和抗原性转变。抗原性漂移变异幅度小，属亚型内变异，由病毒基因点突变和人群免疫力选择所造成，可引起小规模流行；抗原性转变变异幅度大，病毒表面抗原结构发生变异，形成新亚型，由于人群对变异毒株缺少免疫力而容易造成新型流感的大流行[1，5]。如果不同型别病毒同时流行，可发生基因重组而形成新亚型流行性感冒。流感监测是季节性流感防控和流感大流行应对与准备的一项重要策略，通过系统的监测可以明确流感的流行毒株并及早发现变异株，同时可以有效应对流感暴发疫情或流感流行[6]。

流感在中国南方省份与北方省份发病高峰时段不同，南方省份高发月份为6～8月份[7]，北方省份高发期一般为12月～次年1月[8]。山东省为北方省份，流感的高发期为12月～次年1月[9]。菏泽市位于鲁西南地区，每年的流感高发季节特点与山东省基本一致[10]。本市流感病毒分离鉴定结果显示，2015年10月～2016年4月流感病毒分离鉴定阳性率为27.89%。毒株型较为复杂，新甲H1N1型、H3亚型、BV型和BY型均有出现，其中BV型毒株共分离出88株，占全年阳性数的62.86%，为本监测年的优势毒株型。流感病毒分离高峰值出现在次年3月，与其他地市监测结果稍有不同[11-12]，这可能与本地区2015年初冬季节的一场降雪有关，气温骤降致使流感病毒高发期延后。不同月份优势毒株型不同，新甲H1N1型在次年1月出现并很快成为优势株；随着时间的推移，BV型出现并逐渐替代新甲H1N1型成为次年2～4月的优势毒株型，可能与本地区冬季的温度变化及邻近2016年春节外来人口流动性较大有关。从人群特征上看，流感的主要易感人群还是集中在学龄前（0～5岁）与学龄（>5～15岁）儿童，这与其他的报道相符[13-15]，可能与多为幼托儿童和学生密切接触流感更易传播有关。此结论可以看出在流行性感冒来临之前，预防接种流感疫苗并推广流感疫苗在学生人群中的接种率，对于防治流感有积极作用[16]。

流感病原学监测是预防流感的重要技术手段，通过监测及时发现流感的流行趋势与规律，为流感防控工作提供科学依据。在流感暴发或者大流行之前提出预警，尽量减少流感为公众健康和公共卫生带来的危害，减少因流感为公众家庭带来的经济负担。

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