P物质在子宫内膜异位症所致慢性盆腔疼痛患者子宫骶韧带中的表达*

胡 艳 李 环 古漪玲 魏蔚霞 吴瑞芳

(北京大学深圳医院妇产科 深圳市妇科肿瘤医学工程技术研究开发中心，深圳 518036)

·实验研究·

P物质在子宫内膜异位症所致慢性盆腔疼痛患者子宫骶韧带中的表达*

胡 艳 李 环 古漪玲 魏蔚霞 吴瑞芳**

(北京大学深圳医院妇产科 深圳市妇科肿瘤医学工程技术研究开发中心，深圳 518036)

目的 探讨P物质在子宫内膜异位症所致慢性盆腔痛患者子宫骶韧带中的表达。 方法 选择2013年6月～2014年12月26例因子宫内膜异位症所致慢性盆腔疼痛拟行手术治疗的患者为研究组，同期因妇科疾病需行子宫切除术且无子宫内膜异位症和慢性盆腔痛的33例患者为对照组。术中取骶韧带组织，应用实时荧光定量PCR法及免疫组化SP法检测P物质mRNA和蛋白在2组骶韧带中的相对表达水平。 结果 研究组骶韧带中P物质mRNA的相对表达量(中位数0.2129，四分位数间距0.6954)和蛋白的阳性面积百分比(25.6531%±7.0761%)明显高于对照组(中位数0.0364，四分位数间距0.1674，20.2915%±4.3665%)(Z=-2.141，P=0.032；t=3.614，P=0.001)。 结论 子宫内膜异位症所致慢性盆腔痛患者子宫骶韧带中P物质mRNA的相对表达量和蛋白的阳性面积百分比均较无慢性盆腔痛患者高，提示子宫骶韧带中P物质表达增加可能是子宫内膜异位症导致慢性盆腔痛的原因。

P物质; 慢性盆腔痛; 子宫内膜异位症

慢性盆腔疼痛(chronic pelvic pain，CPP)是由各种功能性或器质性原因引起的非周期性以骨盆及其周围组织疼痛为主要症状，时间超过6个月的需要药物或手术治疗的一组疾病或综合征。其病因复杂，涉及生殖系统、泌尿系统、消化系统、肌肉骨骼系统和心理疾患等方面，其中子宫内膜异位症是引起CPP最为常见的妇科疾病。目前对于子宫内膜异位症导致的慢性盆腔疼痛的治疗主要为以抑制雌激素产生和降低雌激素水平为目的的药物治疗，以及腹腔镜异位种植病灶切除的手术治疗。无论是药物、手术或手术联合药物治疗，疼痛都能有不同程度的缓解，但是部分患者容易复发[1,2]，治疗效果不甚满意。因此，重视子宫内膜异位症所致CPP的发病机理研究，从病因学研究找到疾病的根本性治疗方法非常重要。疼痛是伤害性刺激作用于机体引起的一种复杂的心理生理学过程，是一种不愉快的主观感受；神经纤维末梢、神经递质和伤害性刺激是疼痛产生的必备条件。P物质是疼痛产生过程中的致痛神经递质，本研究采用免疫组化SP法和荧光定量PCR法研究P物质在子宫内膜异位症所致CPP患者子宫骶韧带中的表达，探讨P物质与子宫内膜异位症致慢性盆腔痛的关系，为治疗子宫内膜异位症致慢性盆腔痛提供理论依据。

1 临床资料与方法

1.1 一般资料

本研究病例选择和组织提取均征得患者知情同意并通过医院伦理委员会的批准。研究组选取2013年6月～2014年12月因子宫内膜异位症致慢性盆腔疼痛拟行开腹或腹腔镜手术治疗的26例，年龄41～50岁，有慢性盆腔痛病史，近3个月内未使用孕激素类和促性腺激素释放激素激动剂(GnRH-a)等药物，无盆腔手术史，且术中骶韧带可见内膜异位症病灶或骶韧带组织病理检查见内膜异位症病灶。对照组选择同期因为宫颈上皮内瘤变Ⅲ级、早期宫颈癌、子宫肌瘤等拟行开腹或腹腔镜子宫切除术的33例，年龄41～51岁，无慢性盆腔痛等相关疾病，近3个月未使用孕激素和GnRH-a等药物，无盆腔手术史，术中骶韧带未发现子宫内膜异位症病灶且骶韧带的组织病理检查未见子宫内膜异位症病灶。研究组年龄(46.1±2.6)岁，对照组(46.2±2.8)岁，差异无显著性(t=-0.094，P=0.925)，具有可比性。

1.2 标本的收集与处理

研究组行子宫切除或骶韧带切断(或部分切除)手术，术中切取含子宫内膜异位症的骶韧带组织约1.0 cm×0.5 cm×0.3 cm；对照组行子宫切除术时切取骶韧带断端约1.0 cm×0.5 cm×0.3 cm。所取标本1/2置入10%福尔马林溶液中固定后石蜡包埋，待标本收齐后统一4 μm连续切片用于HE染色和免疫组化；剩余1/2标本置入有RNA Later液的EP管内并立即置入-80 ℃冰箱保存，用于实时荧光定量PCR。

1.3 免疫组化SP法

采用免疫组化SP法检测骶韧带中P物质的阳性面积百分比。P物质单克隆抗体(英国Abcam公司)浓度1∶100；免疫组化SP试剂购自福建迈新生物技术开发有限公司，采用德国莱卡公司光学显微镜拍照,Image-Pro Plus计算机图像分析系统计算P物质的阳性面积百分比，以PBS代替一抗作阴性对照。结果判读：采用平均阳性染色面积百分比法对骶韧带中P物质蛋白的表达进行半定量分析。在光镜下观察所有染色切片，P物质阳性表达为棕黄色颗粒，阳性颗粒表达位于细胞浆内及细胞膜上。每张切片随意选取5个完整而不互相重复的×200视野，拍照后用计算机图像分析系统计算5个视野P物质阳性面积平均百分比，得出P物质蛋白的阳性面积百分比。

1.4 实时荧光定量PCR

按Trizol试剂盒说明提取总RNA；采用逆转录试剂盒(TaKaRa公司)合成cDNA，总反应体系为10 μl，反应条件为37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。实时荧光定量PCR法使用Lightcycler480型荧光定量PCR仪，总反应体系20 μl，cDNA模板1 μl，SYBR Premix预混缓冲液10 μl，上游引物0.5 μl，下游引物0.5 μl，加灭菌水至20 μl。各引物序列见表1。按照各目的基因退火温度选择三步法完成扩增，循环数40。每次实验每个模板设置3个复孔保证重复率，重复2次。根据高分辨率熔解曲线判断实时荧光定量PCR法扩增产物的特异性，以磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)为内参。骶韧带中P物质mRNA的相对表达量采用2-ΔCt法计算；其中ΔCt=Ct(目的基因)-Ct(内参基因)。

表1 PCR引物序列

1.5 统计学分析

2 结果

研究组骶韧带内可见子宫内膜异位症(图1)，2组骶韧带中均有P物质表达(图2)；内参GAPDH及P物质的扩增曲线有指数扩增期，有平台期，并且曲线起峰均<40Ct，整条曲线光滑(图3)；熔解曲线峰值单一，无杂峰、双峰或引物二聚体峰信号，内参GAPDH与P物质的熔解温度分别为86 ℃和83 ℃(图4)，表明逆转录产物及引物的特异度均较好，反应条件选择适当。研究组骶韧带中P物质蛋白的阳性面积百分比和P物质mRNA的相对表达量均明显高于对照组(P<0.05)，见表2。

图1 子宫骶韧带中子宫内膜异位症病灶(HE染色，×100) 图2 P物质阳性表达(SP染色，×200) 图3 内参GAPDH和P物质扩增曲线 图4 内参GAPDH和P物质高分辨率熔解曲线

表2 子宫骶韧带中P物质mRNA相对表达量和蛋白阳性面积百分比

组别mRNA相对表达量(M,Q3-Q1)蛋白阳性面积百分比(%)(x±s)研究组(n=26)0.2129,0.695425.6531±7.0761对照组(n=33)0.0364,0.167420.2915±4.3665Z(t)值Z=-2.141t=3.614P值0.0320.001

3 讨论

不同人群中CPP患病率从2.1%～26.6%不等[3]，严重影响患者生活质量，且诊疗困难，CPP已经成为世界性的健康问题[4]。很多妇科疾病，如子宫内膜异位症、慢性盆腔炎、盆腔粘连、子宫肌瘤、盆腔充血综合征以及妇科手术等[5,6]都可能导致CPP，其中子宫内膜异位症是引起CPP最为常见的妇科疾病[7]，半数以上出现CPP症状的女性患者患有子宫内膜异位症，大部分的子宫内膜异位症患者有CPP[8,9]，两者关系密切。研究表明，子宫内膜异位症致CPP的发生与病变严重程度和病变部位有密切关系[10，11]，骶韧带内含有丰富的神经末梢，当子宫内膜异位病灶浸润子宫骶韧带时，骶韧带的挛缩、粘连和增粗，引起各种疼痛，CPP最常见[12,13]，在各种炎性细胞刺激因子作用下，神经末梢敏感性增强，反复作用使疼痛进行性加重[14]。

疼痛是由实质上或潜在的组织损伤引起的不愉快的感觉，神经纤维末梢、神经递质和伤害性刺激是产生疼痛的必备条件。P物质是由11个氨基酸组成的多肽，广泛分布于中枢和周围神经系统及组织器官。其分布部位及作用方式不同，起着神经递质、神经调质或激素样作用。

虽然子宫内膜异位症导致疼痛的发生机制至今尚不清楚，但目前认为子宫内膜异位症疼痛是一种伤害性、炎症性以及神经源性综合的复杂性疼痛。因此，我们观察P物质在子宫内膜异位症所致CPP患者骶韧带中的表达，探讨骶韧带中P物质的表达与子宫内膜异位症致CPP的关系。Tokushige等[15]提出子宫内膜异位症的在位内膜、子宫肌层神经纤维密度增加与盆腔疼痛症状有关，同时，子宫内膜异位症患者子宫内膜功能层分布高密度感觉神经C纤维，对子宫内膜异位症疼痛及痛觉过敏起重要作用。因此，越来越多的学者从神经肽类相关因子如P物质角度研究子宫内膜异位症疼痛的机理，夏平等[16]的研究结果显示，子宫内膜亦见少量P物质神经纤维分布，P物质在子宫内膜异位症模型大鼠中的含量高于非模型组，从而证明子宫内膜异位症疼痛与P物质含量增加有关，推测高水平的P物质可能促使子宫内膜异位症疼痛的发生。本研究的结果表明，子宫内膜异位症致CPP患者骶韧带中P物质mRNA和蛋白的相对表达量均明显高于无CPP患者，提示骶韧带中P物质表达增加可能是子宫内膜异位症导致CPP的原因。骶韧带中P物质表达的增加导致CPP主要与P物质传递痛和P物质致痛有关。在周围神经系统中，P物质主要由一级传入神经元胞体合成，储存于突触小泡内，当神经冲动传递时引发离子通道开放，外钙内流，促使囊泡与突触前膜融合并释放，P物质再通过轴流转运到初级传入神经末梢，发挥传导痛觉的作用[17]。此外，在多种慢性疼痛中，P物质作为疼痛递质通过感觉神经传入纤维向上传递至脊髓中枢，参与疼痛在脊髓中枢的传导和调制[18]。在组织破坏过程中或炎症反应中释放的化学物质(如钾离子、缓激肽、组织胺以及5-羟色胺)会使伤害感受器发生敏化。在此基础上，伤害感受器自身也会释放出痛敏物质激活邻近的伤害感受器，向周围组织扩布疼痛和炎症反应，P物质是其中的重要成分。因此，P物质不仅传递伤害性信息，而且参与感受器的作用。Henry等[19]认为，大剂量P物质可直接引起感觉神经元兴奋，导致痛觉过敏，并掩盖阿片样物质的止痛作用。因此，子宫内膜异位症骶韧带局部P物质表达的升高不仅能增强伤害性信息的传递，而且可直接引起感觉神经元兴奋导致痛觉过敏，而敏化的神经可释放大量神经递质反过来激活肥大细胞等促使其脱颗粒释放致痛物质，促使神经敏化，从而导致神经病理性疼痛的持续状态，即子宫内膜异位症患者的慢性神经病理性疼痛。

综上所述，子宫内膜异位症导致CPP的因素虽然很多，许多情况下并非由单一因素所致，而是由多种因素共同作用的结果。本研究结果提示，子宫内膜异位症致CPP患者骶韧带中局部P物质表达的增加，推测P物质可能在子宫内膜异位症导致CPP的发生中起着重要作用，这对阐明子宫内膜异位症所致CPP的机制，探讨子宫内膜异位症导致CPP可能的镇痛途径提供理论依据，对寻找到新的治疗方案有重要意义。但是，局部P物质的表达与CPP发生发展是否存在必然的关联及其在CPP的发生发展中的作用尚待更多的研究来证实，值得我们今后继续探索。

1 王 晶，陈 滢，杨赛花.腹腔镜手术前后联合醋酸亮丙瑞林治疗子宫内膜异位症的比较研究.中国微创外科杂志，2011，11(6):492-495.

2 张玲玲，应小燕.腹腔镜手术联合促性腺激素释放激素激动剂治疗子宫内膜异位症疗效的比较研究.中国微创外科杂志，2015,15(4):305-308.

3 Ahangari A.Prevalence of chronic pelvic pain among women:an updated review.Pain Physician,2014,17(2):E141-E147.

4 Apte G，Nelson P,Brismee JM,et al.Chronic female pelvic pain-part 1:clinical pathoanatomy and examination of the pelvic region.Pain Pract,2012,12(2):88-110.

5 Ball E,Khan KS,Meads C.Does pelvic venous congestion syndrome exist and can it be treated?Acta Obstet Gynecol Scand,2012,91(5):525-528.

6 Brandsborg B.Pain following hysterectomy:epidemiological and clinical aspects.Dan Med,2012,59(1):B4374.

7 Mao AJ,Anastasi JK.Diagnosis and management of endometriosis:the role of the advanced practice nurse in primary care.J Am Acad Nurse Pract,2010,22(2):109-116.

8 Tirlapur SA,Kuhrt K,Chaliha C,et al.The ‘evil twin syndrome’ in chronic pelvic pain:a systematic review of prevalence studies of bladder pain syndrome and endometriosis.Int J Surg,2013,11:233-237.

9 张震宇.慢性盆腔疼痛的妇科病因.实用妇产科杂志，2007,23(4):194-195.

10 Dai Y,Leng JH,Lang JH,et al.Anatomical distribution of pelvic deep infiltrating endometriosis and its relationship with pain symptoms.Chin Med J,2012,125(2):209-213.

11 胡碧洪，李莉芳，王 帅，等.腹腔镜诊治子宫内膜异位症相关性慢性盆腔痛的临床研究.实用妇产科杂志,2011,27(10):751-753.

12 Yeung P Jr,Sinervo K,Winer W，et al.Complete laparoscopic excision of endometriosis in teenagers:is postoperative hormonal suppression necessary?Fertil Steril,2011,95(6):1909-1912.

13 Daniels J,Gray R,Hills RK,et al.Laparoscopic uterosacral nerve ablaion for alleviating chronic pelvic pain:a randomized trial.JAMA,2009,302(9):955-961.

14 Stratton P,Berkley KJ.Chronic pelvic pain and endometriosis:translational evidence of the relationship and implications.Hum Reprod Update,2011,17(3):327-346.

15 Tokushige N,Markham R,Russell P,et al.Different types of small nerve fibers In eutopic endometrium and myometrium in women with endometriosis.Fertil Steril,2007,88(4):795-803.

16 夏 平，徐邦生，林海英，等.P物质在子宫内膜异位模型大鼠子宫内膜组织中的表达及造模前后痛阈的变化.解剖学杂志，2009,32(1)：32-34.

17 王 凌，李 丽，司军强.P物质与疼痛的关系.包头医学院学报，2009,25(5)：102-104.

18 朱建军.P物质在脊髓痛觉机制中的作用研究进展.交通医学，2007,3(3)：247-248.

19 Henry JL.Future basic science directions into mechanisms of neuropathic pain.J Orofac Pain,2004,18(4):306-310.

(修回日期：2016-01-23)

(责任编辑：王惠群)

Expression of Substance P in Patients with Chronic Pelvic Pain Caused by Endometriosis

HuYan,LiHuan,GuYiling,etal.

DepartmentofObstetricsandGynecology,PekingUniversityShenzhenHospital,ShenzhenTechnicalResearchandDevelopmentCenteronGynecologicOncology,Shenzhen518036,China

WuRuifang,E-mail:wurf100@126.com

Objective To investigate the relationship between substance P expression in uterosacral ligament and chronic pelvic pain caused by endometriosis. Methods A group of 26 patients with chronic pelvic pain caused by endometriosis were treated with surgery as the research group, and another 33 patients without chronic pelvic pain and endometriosis were given hysterectomy as the control group. Streptavidin perosidase immunohistochemistry technique was used to evaluate the expression of substance P in uterosacral ligament. Real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction was used to detect the mRNA expression of substance P in uterosacral ligament. Results The median mRNA relative expressions of substance P were 0.2129 (Q3-Q1=0.6954) in the research group and 0.0364(Q3-Q1=0.1674) in the control group. The percentages of positive staining area of the protein of substance P were 25.6531%±7.0761% in the research group and 20.2915%±4.3665% in the control group. The mRNA relative expressions and the percentage of positive staining area of substance P were significantly higher in the research group than those in the control group (Z=-2.141，P=0.032；t=3.614，P=0.001). Conclusion The increased expressions of substance P in uterosacral ligament of endometriosis patients may be the cause of chronic pelvic pain.

Substance P; Chronic pelvic pain; Endometriosis

2013年广东省医学科研基金(项目编号：A2013609)

A

1009-6604(2016)04-0355-04

10.3969/j.issn.1009-6604.2016.04.018

2015-10-21)

**通讯作者，E-mail：wurf100@126.com