不同剂量Apocynin对重症急性胰腺炎模型大鼠肠组织的保护作用

徐胜，邓文宏，孙荣泽，郭闻一，王卫星△

不同剂量Apocynin对重症急性胰腺炎模型大鼠肠组织的保护作用

徐胜1△，邓文宏2，孙荣泽2，郭闻一2，王卫星2△

目的 探讨还原型辅酶Ⅱ氧化酶（NOX）抑制剂apocynin对重症急性胰腺炎（SAP）模型大鼠肠道损伤的保护作用及剂量关系。方法53只SPF级Wistar大鼠随机分为假手术组（SO组，10只）、SAP模型组（SAP组，12只）、apocynin低剂量组（25 mg/kg，11只）、中剂量组（50 mg/kg，10只）、高剂量组（100 mg/kg，10只）。胆胰管逆行注射5%牛磺胆酸钠溶液制备SAP模型，造模前30 min，各剂量组注射apocynin干预。造模后12 h记录大鼠存活情况，测定各组腹水量、血清淀粉酶（AMY）、丙氨酸转氨酶（ALT）和肌酐（Cr）水平，并取胰腺、回肠组织行HE染色，进行组织病理学分析。结果SAP组死亡2只，apocynin低剂量组死亡1只。SAP组大鼠腹水量、AMY、ALT、Cr水平、胰腺病理评分、回肠病理分级均较SO组明显升高（P＜0.05）。低剂量组Cr、肠病理分级较SAP组降低，其他指标与SAP组比较差异无统计学意义。中、高剂量组腹水量、AMY、Cr、胰腺病理评分、肠病理分级均较SAP组降低（P＜0.05）。高剂量组ALT、Cr水平较中剂量组升高（P＜0.05）。结论Apocynin可改善SAP模型大鼠症状并减轻肠损伤，这可能与其抑制NOX活性有关，50 mg/kg可能是最佳剂量。

胰腺炎，急性坏死性；夹竹桃麻素；重症急性胰腺炎；还原型辅酶Ⅱ氧化酶；腹水；肠损伤；剂量效应关系，药物

重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）是一种常见的危急重症，易引发全身炎症反应综合征，可进展为肺、肾、肝和肠道等多器官损伤，病死率高达40%［1-2］。有观点认为，肠道损伤是SAP时胰腺由原位损伤转向多器官功能障碍的关键因素［3-4］。而氧自由基在SAP肠黏膜屏障损伤过程中起重要作用，还原型辅酶Ⅱ氧化酶（NADPH oxidase，NOX）是血管壁活性氧（ROS）的主要来源［5］。因此，下调NOX表达水平是减轻SAP症状、控制SAP发展的关键。4′-羟基-3-甲氧基苯乙酮（香草乙酮，apocynin）是NOX的特异性抑制剂，本研究通过使用不同剂量apocynin作用于SAP模型大鼠，观察NOX的表达变化及大鼠胰腺和肠道损伤程度，旨在探索apocynin在SAP中的保护作用及剂量效应关系。

1 材料与方法

1.1 材料及分组二甲基亚砜（DMSO）、牛磺胆酸钠购自Sigma公司，使用前无菌生理盐水配制，apocynin购自Santa公司，用前以DMSO溶解至所需浓度。SPF级Wistar大鼠53只，体质量200～250 g，购自湖北省疾病预防控制中心，按照随机区组实验设计分为假手术组（SO组，10只）、模型组（SAP组，12只）、apocynin低剂量组（25 mg/kg，11只）、中剂量组（50 mg/kg，10只）、高剂量组（100 mg/kg，10只）。

1.2 模型制备及干预大鼠术前禁食12 h，腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉，无菌环境下上腹正中切口开腹，以头皮输液针针头穿过十二指肠对系膜缘、经胰乳头逆行插入主胰管，沿胰胆管逆行匀速（0.1 mL/min）注射5%牛磺胆酸钠溶液（1 mL/kg）造模。注射结束5 min后确认沿胰管周围组织出现水肿、出血，提示造模成功；逐层关腹缝合，术后皮下补液（生理盐水2 mL/kg）。造模前30 min，SAP组由股静脉注射10%DMSO溶液（2 mL/kg），apocynin低、中、高剂量组分别由股静脉注射相应剂量的apocynin。SO组则于造模前30 min股静脉注射10%DMSO（2 mL/kg）后，麻醉、开腹，翻动大网膜、胰腺后缝合关腹。

1.3 标本采集及检测术后观察12 h，记录各组大鼠存活情况。处死大鼠，腹部消毒后剖腹，将无菌干棉球放入大鼠腹腔、汲取全部腹水，记录大鼠腹水量。腹水量测定：以电子分析天平分别记录干棉球质量（干质量）及汲取腹水后的质量（湿质量），计算腹水量（g）=湿质量（g）-干质量（g）。心脏采血后分离血清，全自动生化分析测定血清淀粉酶（AMY）、血肌酐（Cr）及丙氨酸转氨酶（ALT）水平。取部分胰头部组织、回肠组织用于病理分析。

1.4 组织病理学分析胰腺组织用10%福尔马林固定24 h，石蜡包埋切片，HE染色。根据Schmidt等［6］的方法，按胰腺组织水肿（0～4分）、胰腺腺泡坏死（0～2分）、出血和脂肪坏死（0～4分）、炎症和血管周围炎性浸润（0～4分）4方面进行详细病理评分。参照Chiu等［7］研究，将小肠黏膜损伤分为6级：0级，正常黏膜绒毛结构；1级，肠黏膜绒毛顶端上皮下间隙增宽；2级，绒毛上皮下间隙进一步扩大，绒毛顶端上皮抬高与固有膜剥离；3级，绒毛两边上皮成块脱落；4级，绒毛上皮完全脱落；5级，黏膜固有膜崩解，出现出血和溃疡。

1.5 统计学方法采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析处理，符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，多组间均数比较单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

Tab.1 Comparison of the contents of AMY,Cr,ALT and histological scores between five groups表1 各组大鼠AMY、Cr和ALT含量及病理评分比较结果（n＝10，）

Tab.1 Comparison of the contents of AMY,Cr,ALT and histological scores between five groups表1 各组大鼠AMY、Cr和ALT含量及病理评分比较结果（n＝10，）

＊＊P＜0.01；a与SO组比较，b与SAP组比较，c与低剂量组比较，d与中剂量组比较，P＜0.05

AMY（U/L）1 236.00±155.72 4 918.20±389.63a4 280.50±271.81 3 698.00±386.93abc3 561.80±393.16b175.504＊＊组别SO组SAP组低剂量组中剂量组高剂量组F腹水量（g）0.16±0.02 7.75±1.06a6.15±0.85 4.53±0.72abc5.12±0.61b147.641＊＊Cr（μmol/L）35.87±5.21 80.25±10.87a47.76±7.23b46.21±6.86ab58.69±7.31bd47.744＊＊ALT（U/L）112.38±10.58 283.26±30.58a269.13±24.49 242.77±27.78ab331.82±39.36d85.486＊＊胰腺病理评分（分）0.05±0.16 7.10±0.56a6.95±0.50 5.30±0.42abc5.20±0.42bc344.944＊＊回肠病理评级（级）0.10±0.32 3.60±0.52a3.00±0.47b2.20±0.42abc2.10±0.32bc101.250＊＊

2 结果

2.1 动物存活情况SAP组死亡2只，apocynin低剂量组死亡1只，其余3组均无死亡。

2.2 腹水量变化SAP组腹水量较SO组显著增加（P＜0.05），低剂量组与SAP组比较差异无统计学意义；中、高剂量组腹水量差异无统计学意义，但均少于SAP组（P＜0.05），见表1。

2.3 AMY、Cr、ALT水平变化SAP组较SO组AMY、Cr、ALT水平均明显升高（P＜0.05），低剂量组与SAP组相比仅出现Cr水平降低，AMY、ALT水平无明显变化；而中剂量组较SAP组AMY、Cr水平均明显降低。高剂量组Cr、ALT水平较中剂量组升高（P＜0.05），AMY水平与中剂量组差异无统计学意义，见表1。

2.4 胰腺组织病理学改变SO组胰腺结构基本正常，无明显水肿、出血及炎症细胞浸润；SAP组胰腺正常结构被破坏，腺泡水肿、出血、坏死明显，大量炎症细胞浸润，病理评分较SO组显著增高（P＜0.05）；低剂量组病理评分与SAP组差异无统计学意义；中、高剂量组胰腺腺泡坏死、出血、炎症细胞浸润，病理评分较SAP组均降低（P＜0.05），而中、高剂量组之间病理评分无明显差异，见表1、图1。

2.5 回肠组织病理学改变SO组回肠显微结构基本正常，黏膜结构完整，无明显缺损、剥离；SAP组镜下见回肠组织绒毛结构受损，部分区域可见绒毛与固有膜剥离、上皮破溃脱落，病理评级较SO组明显增加；低剂量组病理评级较SAP组降低（P＜0.05）；中剂量组肠黏膜绒毛部分脱落，与固有层存在间隙，病理评级较SAP组及低剂量组降低（P＜0.05），但与高剂量组差异无统计学意义，见表1、图2。

Fig.1 Comparison of pathological sections of pancreas between three groups of rats(HE,×200)图1 3组大鼠胰腺病理切片对比（HE，×200）

Fig.2 Comparison of histological sections of intestinal tissues between three groups(HE，,×400)图2 3组大鼠回肠组织病理切片比较（HE，×400）

3 讨论

肠道损伤是SAP发展为多器官功能障碍综合征（MODS）的重要因素之一，SAP发病初期往往合并麻痹性肠梗阻和（或）胃肠功能障碍［2］。研究显示，肠黏膜酸中毒、ROS、细胞因子和炎症介质、中性粒细胞黏附等可导致肠黏膜细胞凋亡增加，绒毛结构丧失，微循环障碍加重，引起肠道功能障碍［8-11］。

NOX作为人体广泛分布的酶类，近几年被证实在心脏氧化应激［12］、肝脏与脑缺血再灌注损伤［13-14］、脓毒症［15］、急性呼吸窘迫综合征［16］等炎症反应中发挥重要的作用，在控制炎症方面具广泛应用前景。炎症反应时，NOX家族发生“氧化爆发”，产生大量ROS，参与信号转导、免疫功能、激素生物合成，构成机体抵抗病原体的第一防线［17-18］。Yu等［19-21］用蛙皮素诱导胰腺炎腺泡细胞AR42J后发现，NOX可介导激活核因子（NF）-κB炎症通路及白细胞介素（IL）-6表达，同时通过上调凋亡诱导因子表达，参与细胞的凋亡过程，而NOX抑制剂二苯基碘（DPI）可有效抑制其凋亡。Gukovskaya等［22］发现NOX可介导胰腺炎小鼠胰腺内蛋白酶的激活过程。而肠损伤作为SAP发展、导致全身损伤的始动步骤，NOX是否也通过上述相似机制，参与SAP肠黏膜屏障损伤，进而加重SAP造成的整体损伤程度，反之，通过抑制NOX活性水平，能否降低SAP造成肠道及整体损伤水平，尚鲜有研究报道。

Apocynin是NOX特异性抑制剂，具有特异性强、作用效价高的特点，目前已成为治疗腹腔尤其是肠道急性炎症的新方向［17，23-25］。Mouzaoui等［23］研究显示apocynin可抑制NOX活性，减少氧自由基生成及降低相关炎症通路激活水平，减轻急性腹腔炎症模型小鼠的肠损伤及整体炎症水平。Rima等［24］发现apocynin可使急性、慢性结肠炎小鼠结肠上皮细胞活性增加、减少氧自由基和肿瘤坏死因子（TNF）-α的生成。Cagin等［25］研究显示apocynin可抑制NADPH氧化酶活性，减少氧化应激和细胞凋亡，防止氧自由基的形成，对大鼠放射性结肠损伤具有保护作用［25］。本研究显示，apocynin可减轻SAP模型大鼠肠道及胰腺损伤，主要表现为腹水量减少，AMY、Cr水平降低，胰腺、回肠病理评分降低。因此，笔者推测apocynin可能通过抑制NOX活性，降低胰酶表达，下调ROS生成及炎症通路激活水平，从而减少胰腺腺泡细胞破坏，起到保护胰腺的作用。值得注意的是，高剂量组较中剂量组的Cr、ALT水平有所升高，提示大剂量apocynin可能造成肝、肾功能损伤，这可能与SAP环境下过量给予apocynin增加肝肾代谢负担有关，具体机制尚待进一步研究。

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（2016-08-24收稿 2016-11-07修回）

（本文编辑 胡小宁）

The protective effects of different doses of apocynin on intestines of rats with severe acute pancreatitis

XU Sheng1△,DENG Wenhong2,SUN Rongze2,GUO Wenyi2,WANG Weixing2△
1 Department of Gastrointestinal Surgery,People’s Hospital of Guangxi Zhuang Automomous Region,Nanning 530021,China; 2 Department of General Surgery,Renmin Hospital,Wuhan University△

ObjectiveTo investigate the optimal dose of apocynin to protect severe acute pancreatitis(SAP)and SAP caused intestinal injury in rats.MethodsA total of 53 SPF male Wistar rats were randomly allocated into five groups:sham operation group(SO group,n=10),SAP group(n=12),low-dose apocynin group(25 mg/kg，n=11),medium-dose apocynin group(50 mg/kg，n=10)and high-dose apocynin group(100 mg/kg，n=10).SAP model was prepared by retrograde infusing 5%sodium taurocholate (1 mL/kg)into biliopancreatic duct of rat.At thirty minutes before modeling,apocynin was injected into rat to intervention.The survival condition was recorded at 12 h after modeling,and blood samples were obtained for detecting serum amylase(AMY), alanine aminotransferase(ALT)and creatinine(Cr).Pancreatic and ileal tissue samples were obtained for HE staining and pathological examination.ResultsTwo rats died in SAP group and one died in low-dose apocynin group.The quantity of ascites, the levels of AMY,ALT,Cr and pancreatic and intestinal pathologic scores were significantly increased in SAP group than those in SO group(P＜0.05).Except the levels of Cr and intestinal pathologic score,there was no significant difference between lowdose apocynin group and SAP group.The quantity of ascites ascites,levels of AMY,Cr and pancreatic and intestinal pathologic scores were significantly lower in medium-dose and high-dose apocynin groups than those in SAP group(P＜0.05).The levels of ALT and Cr were significantly higher in high-dose apocynin group than those of medium-dose apocynin group(P＜0.05).ConclusionApocynin improves SAP symptoms and reduces SAP caused intestinal injury in rats,which may be related to the inhibition of NOX activity,and 50 mg/kg of apocynin is the optimal dose.

pancreatitis,acute necrotizing;apocynin;severe acute pancreatitis;NOX;ascites;intestinal injury;doseresponse relationship,drug

R576

A

10.11958/20160895

国家自然科学基金项目资助（81360081）；武汉大学自主科研项目（2042015kf0090）

1广西南宁，广西壮族自治区人民医院胃肠外科（邮编530021）；2武汉大学人民医院普外科

徐胜（1980），男，副主任医师、博士，主要从事胃肠胰外科与腔镜微创的基础与临床研究

△通讯作者徐胜E-mail:xvsheng@hotmail.com；王卫星E-mail:sate.llite@163.com