草莓表面典型微生物鉴定、16SrDNA同源性分析及附着能力研究(I)

魏 超，郭灵安，代晓航，杨文婷

(1.四川省农科院分析测试中心，四川 成都 610066；2.乐山市农业技术推广站，四川 乐山 614000)

草莓表面典型微生物鉴定、16SrDNA同源性分析及附着能力研究(I)

魏 超1，郭灵安1，代晓航1，杨文婷2

(1.四川省农科院分析测试中心，四川 成都 610066；2.乐山市农业技术推广站，四川 乐山 614000)

按照草莓生长的3个阶段对四川草莓主产区某生产基地进行2年度连续抽样，对分离的草莓表面微生物进行生化鉴定和16SrDNA测序鉴定；假单胞菌、阴沟肠杆菌2种出现率较高的微生物采用最大简约法(MP)进行同源性分析；并对致软腐微生物进行附着和清洗试验。结果表明，沙雷菌，泛菌属泛菌，少动鞘氨醇单胞菌在草莓青果期出现率较高，假单胞菌，阴沟肠杆菌在各个时期不同地域的草莓均有检出；采摘时间及成熟程度不同草莓表面分离的假单胞及阴沟肠杆菌具有同源性但分子水平仍有差异；清洗试验表明10 %的盐水和含氯清洗剂可以改变微生物的渗透压，有效清除表面附着的假单胞菌和阴沟肠杆菌。本试验对草莓表面致腐微生物的研究将为草莓的安全食用提供参考。

草莓；致软腐微生物；系统发育树；食用安全控制

草莓果肉多汁，营养丰富且含有特殊的浓郁水果芳香,但其营养价值高，糖量高、含水量高并且质地柔软的特点，也成为微生物的繁殖生长的温床，草莓表面微生物的大量快速生长一方面加快了草莓腐烂速度，使草莓很难长久保鲜，另一方面草莓表面滋生的致病微生物也为草莓的食用安全带来隐患。在草莓表面微生物的研究中，发现草莓表面分布多种肠杆菌，其中假单胞菌可加速草莓的腐烂，是其致腐微生物之一[1-2]。假单胞菌 (Pseudomonadaceae)微生物化能有机营养，严格好氧，并且假单胞菌附着能力较强，不易清洗去除，有研究表明其为常见的果蔬致腐微生物[3]。阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)，属于肠杆菌科肠杆菌属，为革兰氏阴性粗短杆菌，有周身鞭毛、无芽孢，兼性厌氧，营养要求不高，其广泛存在于自然界中，在人和动物的粪便、泥土、中均可检出，是肠道正常菌种之一，但一定条件下可为条件致病菌。

在对草莓表面微生物连续3年收集整理后，采用16SrDNA 分子检测方法对不同时期草莓上细菌的分布情况进行调查，部分出现率较高的微生物进行同源性分析，研究草莓表面总体微生物种群的的分布关系，并用常见多种清洗方法对草莓表面微生物的去除比较，旨在对食用草莓的风险进行分析，并为找到草莓上细菌污染的干预方法提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

草莓(FragariaananassaDuch.)样品来源2013，2014年，四川省成都市某草莓无公害种植基，根据生长阶段在12月份青果，2月份采摘期及4月份较成熟期各选取5个批次进行微生物筛查，共30份样品。

仪器与试剂：微生物培养及生化鉴定：营养肉汤、脑心浸液、血平板、营养琼脂平板，购于广东环凯，假单胞菌显色培养基购于广州博赛，肠杆菌计数纸片为美国3M公司；微生物鉴定仪器为法国生物梅里埃公ATB细菌鉴定仪；鉴定试剂条为法国生物梅里埃公司ID 32 E。高压灭菌锅，上海三申FM75;DHP-9082 培养箱，上海一恒科学仪器有限公司。

微生物分子鉴定：MasterMix 购于成都博瑞克生物技术有限公司; 微生物裂解液的Lysis Buffer为 Takara 公司； 作引物正向引物(F27):5-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3; 反向引物(R1492):5-TACGYTACCTTGTTACGACT-3，上海英骏生物技术公司合成，测序为上海立菲生物技术有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 微生物分离培养 称取25 g样品，用蛋白质缓冲水(BPW)1∶10 稀释制成增菌液，将增菌液分别有氧、厌氧36 ℃培养18～24 h，后将增菌液划线于血平板、营养琼脂平板、伊红美蓝平板，在36 ℃继续培养24 h，挑取各平板上不同类型菌落形态于营养琼脂平板上纯化。

1.2.2 微生物的理化鉴定 在营养琼脂上培养并挑取可分离的单菌落，进行革兰氏染色和镜检，标记初检结果，使用ATB细菌鉴定仪鉴定，G-菌使用ID 32 E试剂条。鉴定时挑取营养琼脂或血平板上菌落至比浊管，振荡分散，上样前将菌液调至0.5麦氏浊度，用移液器将样品注入试剂条样杯中，由ATB系统自动检测、数据分析并给出最终结果。

1.2.3 微生物分子试验 ①DNA 模板制备。用灭菌牙签或枪头挑至50 μl Lysis Buffer裂解液中，混合，沸水浴15 min，10 000 r/min离心冰浴，取裂解后上清液作为PCR 反应模板。②PCR 反应体系和参数。PCR 反应体系体积为25 μl，Taqmix(2×) 12.5 μl，上下游引物各1μl，模板DNA 1μl，ddH2O 9.5 μl，PCR 反应条件为:94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30 个循环，72 ℃保温10 min。③测序及比对。对目标16 srDNA序列进行双向测序并拼接，将测序结果提交NCBI比对。④系统发育树构建。在Genebank下载覆盖率100 %，拟合度99 %及以上的序列进行比较，用MAGA6软件进行序列分析，相似程度较高的采用最大简约法(Maximum parsimony)进行系统发育树构建。

1.2.4 草莓表面微生物附着及清洗试验 血平板分离纯化草莓分离微生物铜绿假单胞菌(11Y1)、阴沟肠杆菌(19WYU34)，挑取血平板上菌落至比浊管，振荡分散，将菌液调至0.5麦氏浊度(菌体约为1.5×108个/mL),取1 mL 0.5 麦氏浊度菌液与150 mL无菌水中，将草莓浸泡10 min，无菌表面烘干，模拟日常草莓清洗手段，进行4项平行清洗试验，处理分别为：a)自来水连续冲洗10 min，b) 10 %NaCl溶液浸泡10 min，c)含氯消毒剂(C3O3N3Cl2Na)0.2 % 浸泡10 min，d)日常有机清洗剂洗洁精浓度为1 % 浸泡10 min，处理后的草莓进行铜绿假单胞菌、阴沟肠杆菌计数检测。

铜绿假单胞菌计数试验方法为：取待试草莓样品于无菌均质袋均质，按照1︰10比例用无菌生理盐水将样品稀释到合理区间，取1 mL稀释液涂布在假单胞菌显色培养基，36 ℃培养24 h后，对蓝绿色菌落进行计数。阴沟肠杆菌计数试验方法为：取待试草莓样品于无菌均质袋均质，按照1︰10比例用无菌生理盐水将样品稀释到合理区间取1 mL稀释液悬滴于肠杆菌测试纸片，36 ℃培养24 h 后对红色并且周围产生气泡的菌落进行计数。

2 结果与分析

2.1 草莓表面微生物的分离鉴定

采用1.2.1的方法对草莓表面上的细菌进行分离，对出现率最高的5种微生物进行鉴定，鉴定结果见表1，生化图谱见表2。其中深沙雷菌，少动鞘氨醇单胞菌，泛菌属泛菌，在草莓青果期出现率较高，假单胞菌，阴沟肠杆菌在各个时期不同地域的草莓均有检出，编号2WYU35 在理化检测结果为阪崎肠杆菌，但对其16srDNA测序结果进行比对后为阴沟肠杆菌,实验结果表明阪崎肠杆和阴沟肠杆菌在16srDNA亲缘性很接近，但其生化反应所差异。分离阪崎肠杆菌(2WYU35)可发酵a-葡萄糖苷酶，不能发酵a-麦芽糖，L-阿拉伯糖，d-甘露醇，但阴沟肠杆菌可发酵后者。此外假单胞菌科微生物生化检测为2个种，分别为铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌，在16srDNA鉴定中可分为为铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌等。

表1 5种属微生物的鉴定

2.2 微生物分类及16SrDNA同源性分分析

对分离频率较高的微生物阴沟肠杆菌和假单胞菌进行，16srDNA同源性分析比对结果表明分子型总体差异性较小，用分离微生物序列与NCBI比对，覆盖率100 %，相似度99 %归属于阴沟肠杆菌和假单胞菌，鉴于2种微生物间内序列相似成度高根据离散型性状包括形态学性状和分子序列DNA的变异程度，采用最大简约法(Maximum parsimony)，构建生物的系统发育树，并分析生物物种之间的演化关系。阴沟肠杆菌和假单胞菌系统发育树见图1～2。由系统发育树可以看出假单胞菌序列间相似程度较高，大体可以分为2种与生化鉴定结果相符；腐败草莓中分离的假单胞菌基本与编号2lian序列比对100 %一致表明草莓表面致腐微生物的种群结构相对保持稳定。分离的阴沟肠杆菌见差异性较小，与阴沟肠杆菌标准菌株比对有一定差异，但差异不明显，但分离鉴定为阴沟肠杆菌微生物总体与2WYU35即生化鉴定为阪崎肠杆菌微生物差异较明显，虽然在NCBI上微生物2WYU35 16srDNA的鉴定结果为阴沟肠杆菌，但从微生物的分子系统发育和生化反应结果上看，两种微生物还存在明显差异。

图1 假单胞菌系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree of Pseudomonas spp.

2.3 微生物附着与清洗试验

附着与清洗试验结果见表2，处理a～e分别为a)自来水连续冲洗，b) 10 %NaCl溶液浸泡，c)含氯消毒剂浸泡，d)日常有机清洗剂洗洁精浓度浸泡，e)无清洗对照；样品1～3分别为青果，红果，微腐烂果。草莓较易附着微生物，无论何种清洗方法都无法将草莓表面的微生物彻底祛除，这与草莓浆果的表皮构成有关；相比较下阴沟肠杆菌对青果与果红附着能力相近，但较易附着微腐烂果，假单胞菌对3

图2 阴沟肠杆菌系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of Enterobacte spp.

微生物计数(CFU/g)Microorganismcounting样品1Sample1样品2Sample2样品3Sample3假单胞菌Pseudomonas阴沟肠杆菌Enterobacte假单胞菌Pseudomonas阴沟肠杆菌Enterobacte假单胞菌Pseudomonas阴沟肠杆菌Enterobacte处理a3.5×102.2×1029.5×101.0×1021.2×1023.6×102处理d<102.5×10<103.5×104.0×101.0×10处理c<101.5×101.0×10<10<102.5×10处理d2.0×1021.9×1022.4×1026.2×1025.6×1025.8×103处理e2.5×1023.4×1033.8×1021.2×1039.2×1021.1×104

表3 草莓微生物鉴定图谱

注：ID 32 E 试剂条：LIP 酯酶，βNAG β氮乙酰葡萄糖胺，MAL d-麦芽糖，GLU d-葡萄糖，SAC 蔗糖，GAT d-半乳糖酸盐同化，URE 尿素酶，AHD 精氨酸双水解酶，INO 肌醇，aMALa-麦芽糖，CEL d-纤维二糖，βGAL 半乳糖苷酶，AspA L-天门冬素芳胺酶，TRE d-海藻糖，aGLU a-葡萄糖苷酶，LARA L-阿拉伯糖，ODC 鸟氨酸脱羧酶，IND 吲哚，MAN d-甘露醇，RP 酚红，5KG 5酮基·葡萄糖酸钠，LARL L-阿拉伯醇，LDC 赖氨酸脱羧酶，βGLU β-葡萄糖苷酶，MNT 丙二酸盐，SOR d-山梨醇，βGUR β葡萄糖醛缩酶，ADO 侧金盏花醇，RHA L-鼠李糖，aGAL a-半乳糖苷酶，DARL D-阿拉伯醇, PLE 古老糖。

种情况的草莓附着能力相近，这与微生物的菌毛性结构与草莓表面种子形成的凹凸结构有关[4]；由清洗试验可以看出，阴沟肠杆菌比假单胞菌更易消除，自来水冲洗可以将草莓表面部分微生物降低1～2个对数单位，日常有机清洗剂洗洁精浓度浸泡对微生物消除降低0～1个对数单位，10 % NaCl溶液浸泡，和含氯消毒剂浸泡可有效的降低草莓中假单胞菌和阴沟肠杆菌的数量，含氯消毒剂是国内外水果加工有效的微生物去除剂，10 % NaCl溶液可以改变微生物及草莓表皮的渗透压，有效的去除此2种微生物表面附着。

3 讨 论

3.1 微生物同源性分析

在对不同时期微生物的16srDNA进行同源性分析时，实验结果证明不同时期不同样品草莓上分离的假单胞菌属微生物的基因机构基本稳定，假单胞菌分子分类学通过rRNA寡核苷酸分成rRNAⅠ～Ⅳ组，Ⅰ组包铜绿假单胞菌，致金色假单胞菌，恶臭假单胞菌，丁香假单胞菌等[5]，试验分离的假单胞菌虽然在生化反应有所差异，但假单胞菌特征性反应相同，且16srDNA相似度较高，对于草莓上假单胞菌的更多特性还需要进一步研究。本实验在做阴沟肠杆菌分离时，由于阪崎肠杆菌和阴沟肠杆菌的相似性，在16srDNA鉴定中并没有分开。阴沟肠杆菌为是肠道正常菌种之一，但可作为条件致病菌，阪崎肠杆菌为致病菌，可引发的婴儿、早产儿脑膜炎、败血症及坏死性结肠炎，2种微生物在第二版《伯杰系统细菌学手册》(2005)归类于不同种。对阪崎肠杆菌分类起初被认为是肠杆菌科、肠杆菌属 (Enterobacter)中阴沟肠杆菌的生物变型菌，并被命名为“黄色阴沟肠杆菌(yellow-pigmented Enterobacter cloacae)”， ATCC29544 被作为此变型种的模式菌株。Farmer 等将其收集的 57 株阪崎 肠杆菌进行 DNA 杂交、生化反应、黄色菌落产物以 及抗生素敏感性等一系列实验，结果发现但是其表型和 DNA 相似性与肠杆菌属中的阴沟肠杆菌(50 %)更加接近，由此将其归于肠杆菌属与黄色阴沟肠杆菌分开。2007 年 Iversen 等[6]对 210 株阪崎肠杆菌进了:包括全长 16S rRNA 基因序列 分析，荧光标记-扩增性片段长度多态性指纹图谱 [fluorescentlabelled Amplified Fragment Length Polymorphism(f-AFLP) fingerprints]、核 糖 体 分 型 (ribotyping) 等测定，提出了阪崎肠杆菌重新分类的建议。通常2个菌株的 16S rRNA 基因全长序列相似性在 98.7 %～99 % 以上， 并且 DNA 杂交的相关性超过 70 % 时，这2个株应为同一种，同种的2个菌株的 AFLP 图谱相似性应 大于 50 %[7-8]。分离的阪崎肠杆菌和阴沟肠杆菌虽在生化反应上相似，但阪崎肠杆菌D-山梨醇反应为阴性，且16S rRNA相近性较其它鉴定为阴沟肠杆菌的微生物较远，本实验也间接证明了两种微生物在分类学上的不同地位。

3.2 微生物的附着与清洗

微生物表面存在鞭毛蛋白是附着因子[9]，帮助其附着在果蔬表面，清洗可以清除果蔬表面部分微生物，但草莓为浆果，颗粒籽镶嵌在果实表面，较易出现在微观疏水区[10-11]，微生物附着其中，达不到清洗的目的。本实验也验证了自来水等清洗方法对草莓表面微生物的祛除虽有一定作用，但是不能完全祛除草莓表面微生物，致软腐微生物增殖对草莓的保鲜及食用安全带来隐患。微生物的附着存在于生产和销售的各个环节，为了最大程度减少有害微生物在植物上的传播和增殖，建立相关的农业生产指南是非常有必要的。除了加强草莓表面微生物的附着的研究，对草莓表面微生物的协同也拮抗，及致病能力研究也应该得到重视。对易染且不易清洗果蔬微生物的研究可以为果蔬的食用安全保驾护航。

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(责任编辑 陈 虹)

Research on Identification, 16SrDNA Homology and Adhesion of Typical Microorganisms on Surface of Strawberry(I)

WEI Chao1, GUO Ling-an1, DAI Xiao-hang1, YANG Wen-ting2

(1.Analysis and Testing Center of Sichuan Academy of Agricultural Sciences,Sichuan Chengdu 610066,China; 2.Leshan Municipal Bureau of Agriculture,Sichuan Leshan 614000,China)

In this paper, the biochemical identification and 16SrDNA sequencing identification of the microorganisms on the surface of the sampled strawberry in three stages in the main strawberry producing areas of Sichuan for continuous two years were conducted; Maximum parsimony was adopted to conduct homology analysis for two kinds of microorganisms(PseudomonadaceaeandEnterobactercloacae) with relatively high existing possibility; And besides, the test of adhesion and cleaning of microorganisms led to the rot of strawberry was also carried out. The results showed thatSerratiaspp.，Pantoeaspp.,Sphingomonaspaucimobilisall had a comparatively high detection rate in the unripe strawberry,PseudomonadaceaeandEnterobactercloacaewere detected on the surface of strawberry sampled in all periods, in addition, they have homogy but differ at the molecular level with the difference of the picking time and maturity of strawberry.Cleaning experiment demonstrated that 10 % saline and chlorine-containing detergent could change the osmotic pressure of microorganism and effectively remove thePseudomonadaceaeandEnterobactercloacaeattached to the surface of strawberry. Through the research on microorganisms that cause the rot of strawberry, the experiment would provide protection for the safe consumption of strawberry.

Strawberry；Bacterial soft rot；Phylogenetic tree；Hazard analysis critical control

1001-4829(2016)12-2939-05

10.16213/j.cnki.scjas.2016.12.030

2016-01-10

四川省财政创新能力提升工程项目(2013XXXK-022)；国家农产品质量安全风险评估重大专项(2016)；食生鲜果蔬病源微生物调查与产品安全性评估(GJFP201601302)

魏 超(1985-)，女，黑龙江人，助理研究员，主要研究微生物检测与风险评估，Tel:15928404656。

S668.4

A