乳腺癌细胞中化疗药物对Ser10磷酸化p27kip1表达的影响

吕青山，郭志琴，邬万新

乳腺癌细胞中化疗药物对Ser10磷酸化p27kip1表达的影响

吕青山，郭志琴，邬万新

目的探讨肿瘤化疗药物对乳腺癌MDA-MB-231细胞中第10位丝氨酸（Ser10）磷酸化的细胞周期素依赖性激酶抑制蛋白p27kip1（P-p27Ser10）表达的影响。方法分别用化疗药物多西他赛（DOC）、表柔比星（EPI）及两者联合处理乳腺癌MDA-MB-231细胞，运用MTT比色法测定化疗药物对乳腺癌细胞活力的影响；采用Western Blot检测化疗药物处理前后P-p27Ser10、Jab1和p27kip1蛋白表达水平。结果化疗药物DOC、EPI及两者联合处理对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖均有抑制作用，且随化疗药物浓度的增加抑制率增强，两药联合处理有更强的抑制作用。化疗药物处理后，P-p27Ser10和Jab1蛋白表达增加，p27kip1蛋白表达降低，与单一用药相比，联合处理组蛋白表达改变更为明显。结论肿瘤化疗药物可能是部分通过p27kip1Ser10的磷酸化变化引起p27kip1及相关分子Jab1的改变，从而介导乳腺癌细胞的周期调控。p27kip1Ser10磷酸化调节作用可能成为治疗乳腺癌的新途径。【关键词】乳腺肿瘤；p27kip1；磷酸化；化疗敏感性

乳腺癌是危害女性健康的主要恶性肿瘤。近年来，其发病率呈逐年上升趋势，已位居女性癌症病死率的首位[1]。化疗是乳腺癌综合治疗的重要手段之一，可明显提高患者的生存率，但乳腺癌细胞存在多药耐药现象，研究乳腺癌细胞耐药性产生的具体机制是目前急需解决的难题。研究表明，p27kip1是一种重要的细胞周期素依赖性激酶抑制蛋白，可作为潜在的化疗敏感性的预测指标[2-3]。磷酸化是调节p27kip1蛋白表达和亚细胞定位的重要机制[4]。据报道，在p27kip1出核降解前必须经历第10位丝氨酸（Ser10）的磷酸化，而Ser10磷酸化的p27kip1（P-p27Ser10）可以与c-Jun激活区结合蛋白1（Jab1）特异性结合，实现p27kip1出核转运，参与细胞周期调控[5]。因此，本研究通过检测乳腺癌MDA-MB-231细胞中P-p27Ser10和相关蛋白Jab1在临床常用化疗药物处理前后的表达改变，分析化疗药物对其表达的影响，为进一步优化乳腺癌化疗方案提供理论依据。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料人类乳腺癌细胞株MDA-MB-231购自中科院上海细胞库。

1.2 主要试剂兔抗人p27kip1多克隆抗体（C-19，美国Santa Cruz公司）；兔抗人P-p27Ser10多克隆抗体（34-6300，美国Zymed公司）；小鼠抗人Jab1单克隆抗体（611618，美国BD公司）；辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG、抗小鼠IgG和-肌动蛋白（-actin）单克隆抗体（美国Sigma公司）；增强化学发光（ECL）试剂盒（美国Pierce公司）。含青霉素100 U/ml、链霉素100g/ml、10%胎牛血清的RPMI 1640培养基（美国Gibco公司），MTT试剂盒（美国Sigma公司）。

1.3 人乳腺癌MDA-MB-231细胞培养加入含10%胎牛血清的RPMI1640培养基，于37℃、5%CO2及饱和湿度的培养箱中培养。2～3 d后，用2.5 mg/ml胰酶消化，细胞传代一次。实验取对数生长期细胞。

1.4 化疗药物配制实验选用药物为多西他赛（docetaxel，DOC，江苏扬子江药业集团有限公司）和表柔比星（epirubicin，EPI，浙江海正药业股份有限公司）。所用药物的100%测试药物浓度（TDC）为按国家药物常规用量在药代动力学的指导下测出的血浆内峰浓度（PPC）[6]。实验药物浓度分别为0.2、1和5×PPC浓度，联合用药组浓度与单一用药组浓度一致。上述药物用0.9%氯化钠注射液稀释成工作液。

1.5 MTT操作步骤实验分为空白组、对照组和实验组。实验组分：DOC单药处理组、EPI单药处理组和两药联合处理组。空白组：无细胞培养液90 l加10 l 0.9%氯化钠注射液；对照组：细胞悬液90 l加10 l0.9%氯化钠注射液；单药处理组：细胞悬液90 l加10 l化疗药；两药联合处理组：细胞悬液90 l加各5 l化疗药。每组复种5孔。置于37℃、5%CO2及饱和湿度的培养箱中培养48h后，加MTT（5mg/ml）稀释液，20 l/孔。继续培养4h后，加入10%十二烷基硫酸钠100 l/孔，溶解甲膳，终止反应。在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度（OD）值（测量波长570 nm，参考波长630 nm），取每组5孔OD的平均值作最后结果。按下述公式计算细胞生长抑制率：抑制率（IR）＝（OD

1.6 Western Blot检测根据试剂说明书，用细胞裂解液RIPA提取细胞总蛋白，并用bradford法检测所提取蛋白的浓度；取等量蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，湿转法将凝胶上蛋白转移至PVDF膜；室温封闭2 h；加一抗（p27kip1，1︰800；P-p27Ser10，1︰1 000；Jab1，1︰600；-actin，1︰2 000），室温孵育1 h，4℃冰箱过夜；HRP耦联的二抗（1︰1000）室温孵育2h；ECL显色。Bio-Rad Quantity分析软件测定区带的OD，-actin作内参对照，用目的片段与-actin的OD比值表示蛋白表达水平。

1.7 统计方法采用SPSS19.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差表示，两样本均数比较采用独立样本检验；多组均数间比较采用单因素方差分析，两两比较用检验。＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 化疗药物DOC和EPI对乳腺癌MDA-MB-231细胞活力的影响MTT法分析结果显示，DOC和EPI分别以0.2、1和5倍PPC浓度作用MDA-MB-231细胞48h后，对MDA-MB-231细胞增殖均有明显的抑制作用，且随着药物浓度的增加，抑制率也增加，呈明显的剂量依赖性。与单一用药相比，两药联合处理抑制作用更强。在1倍PPC浓度下，对细胞的抑制作用最为明显。见表1。

2.2 乳腺癌细胞中P-p27Ser10、Jab1和p27kip1蛋白表达Western Blot检测结果显示，化疗药物处理后，P-p27Ser10和Jab1蛋白表达均明显增高，且两药联合处理组增加最为明显，而p27kip1蛋白在化疗药物处理后表达降低。见封二彩图4。

表1 MTT法检测DOC和EPI对乳腺癌MDA-MB-231细胞活力影响

3 讨论

乳腺癌辅助化疗是乳腺癌整体治疗方案的重要组成部分。化疗一方面可以保留乳房，提高患者的生存质量，另一方面可以延长患者的生存时间，提高生存率。然而，化疗面临的最大问题就是化疗耐药和对人体的毒副作用，这不仅降低化疗效果，而且加速疾病的进展。大多数化疗药物是针对细胞周期的某个环节设计的，它们通过破坏细胞周期的正常进程，从而促进其对肿瘤细胞的杀伤作用，如果细胞周期发生改变，则可能引起肿瘤细胞的化疗耐药。因此，研究细胞周期调控与肿瘤化疗药物敏感性的关系可为探索肿瘤化疗耐药产生的机制，进而寻找干预手段提供有意义的线索。

p27kip1作为一种重要的细胞周期负性调节因子，其蛋白表达和活性改变与乳腺癌的发生发展及预后密切相关[7-8]。Brown等[9]研究发现，p27kip1低表达可能参与介导乳腺癌细胞对多西紫杉醇的耐药性。但有学者研究发现，乳腺癌细胞中p27kip1高表达，使癌细胞增殖率降低，对环磷酰胺不敏感，而下调其表达，敏感性逐渐恢复[10]。上述p27kip1蛋白对化疗敏感性预测的不一致，可能是由于这些研究只检测该分子蛋白表达，而没有考虑磷酸化对其功能活性的影响。p27kip1分子内存在数十个潜在磷酸化位点，其中，Ser10是主要的磷酸化位点，占p27kip1蛋白总磷酸化水平的70%以上[11]。研究显示，当细胞进入S期，Ser10发生磷酸化，在出核相关分子Jab1等的作用下，Ser10磷酸化的p27kip1出核转运到细胞质，从亚细胞定位角度调节p27kip1蛋白的功能[12]。因此，研究Ser10磷酸化水平与化疗药物敏感性的关系具有十分重要的意义。

体外药敏试验是临床肿瘤治疗中常用且相当重要的方法，开展肿瘤药敏试验并以药敏试验结果指导临床肿瘤化疗有着重要意义。MTT比色法以简便、快捷、可评率高及观察终点客观等优点用于多种肿瘤的体外药敏试验中。MDAMB-231是一种三阴性（即雌激素受体、孕激素受体和表皮生长因子受体2均为阴性）乳腺癌细胞株，具有高侵袭性，高转移性和恶性度高的特性。因此，本研究利用乳腺癌MDA-MB-231细胞模拟乳腺癌患者的体内环境，采用MTT比色法测定化疗药物对其细胞活力的影响，分析p27kip1Ser10磷酸化与化疗药物敏感性的关系。MTT结果显示，临床常用化疗药物DOC和EPI对MDA-MB-231细胞增殖均有明显的抑制作用，随着药物浓度的增加，抑制率增强，且两药联合处理对乳腺癌细胞的抑制作用更强，这证实了蒽环类和紫杉类化疗药物仍是目前临床治疗乳腺癌的有效药物的观点，且联合用药方案更为有效，但具体哪类药物更有效还未知。上述这些结果提示，p27kip1Ser10磷酸化及相关分子Jab1蛋白表达增加，可使细胞核内的p27kip1出核转运到细胞质，调节p27kip1核内外分布，降低p27kip1在细胞核中的表达水平，这一过程可能在乳腺癌化疗药物敏感性中发挥重要作用。当然，乳腺癌是一种高度异质性的肿瘤，仅利用单一的乳腺癌细胞株来进行研究，存在一定的局限性，应进一步从不同分子表型的乳腺癌新鲜组织标本着手，探讨p27kip1Ser10磷酸化对乳腺癌化疗敏感性的影响。

综上所述，乳腺癌化疗药物改变p27kip1Ser10磷酸化及Jab1蛋白表达水平，参与细胞周期调控，从而抑制肿瘤生长。但是化疗药物进行肿瘤细胞周期调控的具体机制还要进一步证实。本研究为进一步从分子水平研究p27kip1磷酸化与乳腺癌化疗药物敏感性关系打下良好的实验基础。今后将进一步进行体内实验研究和机制探讨，为其临床应用提供科学依据。

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1671-0800(2016)12-1597-03

2016-04-10

（本文编辑：陈志翔）

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郭志琴，Email：guozhq@foxmail.com