β-catenin在口腔鳞状细胞癌中的表达及临床意义

马竹君 冯红超 宋宇峰 高琼 孙昊轩

(1.贵州医科大学，贵州 贵阳 550004；2.贵阳市口腔医院，贵州 贵阳 550002；3.贵州省食品药品监督管理局，贵州 贵阳 550000；4.贵州医科大附属口腔医院颌面外科；5.河北省眼科医院口腔颌面外科，河北 邢台 054001)



β-catenin在口腔鳞状细胞癌中的表达及临床意义

马竹君1冯红超2△宋宇峰3高琼4孙昊轩5

(1.贵州医科大学，贵州 贵阳 550004；2.贵阳市口腔医院，贵州 贵阳 550002；3.贵州省食品药品监督管理局，贵州 贵阳 550000；4.贵州医科大附属口腔医院颌面外科；5.河北省眼科医院口腔颌面外科，河北 邢台 054001)

目的 检测口腔鳞癌中上皮间质化(EMT)相关蛋白和β-连环素(β-catenin)的表达初步探讨其意义。方法 用免疫组法检测32例口腔鳞癌组织及正常组织中上皮标记物：上皮-钙黏蛋白(E-cad)及细胞角蛋白(CK)、β-catenin的表达。结果 口腔鳞癌组β-catenin表达明显高于正常组织组(P<0.05)，CK及E-cadherin表达明显低于正常组织组(P<0.05)；β-catenin在T4+T3组的表达显著高于T1+T2组(P<0.05)，E-cadherin的表达明显低于T1+T2组(P<0.05)；有淋巴结转移组β-catenin表达高于无淋巴结转移组(P<0.05)，E-cadherin、CK表达低于无淋巴结转移组(P<0.05)。结论 口腔鳞癌组织中存在EMT现象，E-cadherin、CK及β-catenin在OSCC与正常组织表达中有差异，β-catenin可能参与OSCC组织发生EMT的进程，促进口腔鳞癌浸润及转移。

口腔鳞癌； β-连环素； 细胞角蛋白； 上皮-钙黏蛋白； 上皮间质化； 淋巴结转移

口腔鳞状细胞癌(OSCC)是口腔最常见的恶性肿瘤，其颈部淋巴结转移是目前临床上肿瘤致死的主要因素[1]，严重威胁人类的生命健康。上皮细胞-间充质转化(EMT)，指上皮细胞通过特定程序转化为具有较高侵袭能力的间质表型过程[2]。近年来，国内外对于EMT的研究开始向肿瘤领域延伸。本实验通过免疫组化PV二步法检测正常口腔组织和OSCC组织中β-catenin和EMT标记物的表达，初步探索β-catenin与EMT现象的关系。

1 材料与方法

1.1 材料 收集贵医附院口腔颌面外科2009年7月至2015年7月手术切除的，术前未采用任何针对肿瘤的治疗(如放疗、化疗等),经组织蜡块保存完好的口腔鳞癌标本。均经常规病理检查确诊为鳞状细胞癌患者32例(男23例，女9例)，年龄42～78岁，平均60岁；高分化21例，中低分化11例；无淋巴结转移13例，有淋巴结转移19例，无发生远处转移者。另设12例口腔黏膜正常组织作对照。

1.2 试剂 小鼠抗人细胞角蛋白(广谱)单克隆抗体、小鼠抗人E-cadherin单克隆抗体及DAB显色试剂盒、免疫组化PV试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司，小鼠抗人β-catenin单克隆抗体购自恩晶生物技术有限公司。

1.3 实验方法 免疫组织化学染色行PV二步法，组织蜡块经厚5 μm连续切片，脱蜡水化后，柠檬酸抗原修复液高压热处理修复抗原，3%去离子水封闭内源性过氧化物酶分别加入：β-catenin(1∶50)、E-cadherin(1∶100)、细胞角蛋白(1∶100)一抗工作液、4 ℃孵育过夜。加入生物素化二抗，DAB显色，苏木素复染，中性树胶封固。PBS代替一抗，做阴性对照。实验程序严格按照试剂说明书进行。另取一张切片行苏木精-伊红(HE)染色。

1.4 结果判定 免疫组织化学及原位杂交每例切片随机选择10个视野(放大200倍)拍照。参考相关文献，以Imagepro-plus图像分析系统进行平均光密度(MOD)分析，分析中进行了光密度校准及空间标定，按照阳性表达在照片中的范围在照片中画出测量区域，即总面积(Area Sum)，读取积分光密度(IOD)数值，作为这张照片的累积光密度值。MOD计算方法为MOD=IOD/Area(Sum)。

1.5 统计学方法 采用SPSS18.0统计软件统计，β-catenin、E-cad、CK光密度不满足正态分布，参数检验(P>0.05)，故采用中位数及四分位间距M(P25，P75)表示。正常组织与口腔鳞癌组织光密度的差异及不同临床特征下β-catenin、E-cad、CK光密度比较，采用Mann-Whitney非参数检验，检验水准为双侧α=0.05，P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 β-catenin、E-cadherin、CK在OSCC及正常组织中的表达 β-catenin在正常口腔鳞状上皮组织细胞质中少量或几乎无表达(图1A)，在OSCC组织细

胞质中表达增多，呈棕黄色或棕褐色颗粒，在有的OSCC组织中存在细胞核的表达(图1B)。E-cad阳性信号主要定位于正常组织上皮细胞(图1C)，在OSCC组织中多表达于有细胞极性的鳞状上皮部分，少数呈淡黄色的不均质点状分布，多数癌巢组织无着色表现(图1D)；CK主要定位于细胞质，与正常组织表达相比(图1E)，在癌巢部位的表达较低(图1F)。

图1 免疫组织化学染色结果 (SP×20)

2.2 β-catenin、E-cad、CK在OSCC与正常组织表达的MOD值 β-catenin、E-cad、CK在OSCC与正常组织表达的MOD值见表1，在OSCC组织中，E-cad及CK的表达明显低于正常组织(P<0.05)。

表1 β-catenin、E-cad、CK在OSCC与正常组织表达的MOD值

2.3 OSCC组织中β-catenin、E-cad、CK表达与临床病理资料的关系 OSCC组织中β-catenin、E-cad、CK表达与临床病理资料的关系见表2。β-catenin、E-cad在有淋巴转移组中高于无淋巴结转移组(P1=0.013，P2<0.01)，在T1+T2分期中表达低于T3+T4分期(P1=0.013,P2=0.004)；CK在有淋巴转移组中高于无淋巴结转移组(P=0.048)，以上差异均有统计学意义(P<0.05)；β-catenin、E-cad、表达在不同分化组中无明显差异；CK的表达在不同肿瘤分期中无明显差异(P>0.05)。见表2。

表2 OSCC组织中β-catenin、E-cad、CK表达与临床病理资料的关系

3 讨 论

Wnt/β-catenin信号通路，是一类进化非常保守的信号通路，它通过激活有关靶基因以控制细胞生长、分化、凋亡等方式，参与机体胚胎发育增殖、分化等过程[3]。在成熟细胞中处于关闭状态。近年来研究[4]显示，当Wnt/β-cat信号通路被异常激活时，其可参与肿瘤的形成，同时其与肿瘤EMT的发生，尤其是上皮源性肿瘤的EMT发生密切相关。

E-cad，是一种重要黏附分子，最经典的上皮细胞标志物。在细胞膜上，E-cad与β-catenin形成复合体，维持细胞连接并参与信号传导。目前研究[5]发现，在结直肠癌等肿瘤中发现E-cad的表达下调，认为E-cad的减少或丢失是上皮来源的肿瘤细胞侵袭的前提条件，是发生EMT的重要标志。CK 是上皮细胞特征性标记物，具有多个亚型，根据上皮细胞类型及分化阶段的不同，可有不同亚型的CK表达[6]。本研究结果显示，E-cad、CK在OSCC组织中表达低于正常组织，这与多数研究结果相似，提示OSCC中上皮标记物减少；本研究结果显示，E-cad、CK在无淋巴结转移组表达较有转移组高，提示OSCC发生淋巴结转移与E-cad和CK的异常表达密切相关，OSCC瘤细胞可能失去上皮细胞表型而向间质细胞转化，发生EMT现象。

β-catenin是一种可溶性蛋白，具有双重作用。一方面与E-钙粘素形成复合体，维持上皮极性和完整性；另一方面，作为Wnt通路的关键蛋白在机体发育时期调节细胞的增殖。 β-catenin在细胞质内表达增高及细胞核表达是Wnt/β-cat信号通路激活的重要标志，在成熟机体中，β-catenin在细胞质中表达较少甚至几乎无表达，β-catenin异常表达增高是此信号通路参与肿瘤进程的关键[7]，已有研究[8-9]发现，在结肠癌，原发性肝细胞癌中，β-catenin出现高表达，在已完成EMT转化的结肠癌中，细胞质中的β-catenin积累水平较高。本研究结果显示，β-catenin在OSCC中表达较正常组织高(P<0.05)，在T1+T2 期表达较T3+T4低(P<0.05)，这一研究结果与大多数临床研究结果相似，提示在OSCC中β-catenin发生了异常高表达，随着肿瘤累及越大，β-catenin的表达越高；本研究显示，β-catenin在发生淋巴结转移组表达较未发生淋巴结转移组高，提示β-catenin的异常高表达与淋巴结转移密切相关。本实验证实，E-cad、CK、β-catenin在OSCC中异常表达，OSCC可能存在EMT现象，β-catenin在OSCC细胞出现异常高表达。我们认为，Wnt/β-cat信号通路可能被异常激活，使瘤细胞得以增殖、分化失控，分化失控有可能使瘤细胞由上皮细胞向间质细胞转化，获得迁移能力，促进EMT发生[10]，使OSCC发生淋巴结转移。

本实验通过研究E-cad、CK、β-catenin在OSCC中的表达，证实在人OSCC中存在EMT现象。通过分析各因子与临床病理资料之间关系，我们认为Wnt/β-cat通路可能参与OSCC中EMT的发生，β-catenin是其中的重要因子，与EMT的发生有关。β-catenin不仅是Wnt/β-cat信号通路的关键蛋白，也与E-cad一起维持细胞间连接的稳定，干扰β-catenin在瘤组织中的表达水平，并维持其与E-cad复合体的稳定，从而维持细胞间紧密连接，降低细胞移动的趋势，有可能成为控制肿瘤发生EMT，降低肿瘤侵袭转移率的新的研究方向。

[1] 冯红超，宋宇峰，魏宏琳，等.巨噬细胞移动抑制因子和基质金属蛋白酶2在口腔癌生长和转移中的作用[J].现代口腔医学杂志，2009，23(2):135-137.

[2] 邹丹丹，汤显斌.上皮细胞间质转化与肿瘤干细胞[J].中华病理杂志，2013,42(1)：62-65.

[3] Dan Huang,Xiang Du.Crosstalk between tumor cells and microenvironment via Wnt pathway in colorectal cancer dissemination[J].World J Gastroenterol，2008，14(12);1823-1827.

[4] Miguel Angel Chiurillo.Role of the Wnt/b-catenin pathway in gastric cancer: An indepth literature review[J].World J Exp Med，2015，5(2): 84-102.

[5] Elena Scarpa, Andra s Szabo.Cadherin Switch during EMT in Neural Crest Cells Leads to Contact Inhibition of Locomotion via Repolarization of Forces[J].Developmental Cell 34, 2015,34(4):421-434.

[6] Chu PG, Weiss LM.Keratin expression in human tissues and neoplasms.Histopathology 2002 ;40:403-439.

[7] Hans Clevers,Roel Nusse.Wnt/β-catenin Signaling and Disease[J].Cell,2012,149:1192-1205.

[8] 何绍亚，向阳生.不同结肠组织中β-catenin和TGF-β1表达与临床病理的关系研究[J].贵州医药，2015，39(9)：831-832

[9] 程云娟，罗新华，程明亮.人原发性肝癌组织中AEG-1、β-catenin和C-myc的表达及其意义[J].贵州医药2015，39(11)：967-969.

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Expression and significance of β-cateinin in OSCC

MaZujun,FengHongchao,SongYufeng,GaoQiong,SunHaoxuan.

1.GuizhouMedicialUniversity,Guiyang550004,China. 2.GuiyangStomatologicalHospital,Guiyang550004,China. 3.FoodandDrugAdministrationBureauinGuizhouProvince,Guiyang550004,China. 4.DepartmentofOralandMaxillofacialSurgery,GuizhouMedicialUniversity,Guiyang550004,China. 5.DepartmentofOralandMaxillofacialSurgery,HospitalinHebeiProvince,Xintai054001,China.

Objective To investigate the expression and clinical significance of β-catenin and EMT correlated protein. Methods 32 cases of OSCC and 10 cases of nomal human were detected by IHC to explore the expression of β-catenin and epithelial drived markers which were E-codherin and Cytokeratin. Results The expression of β-catenin in is significantly higher than that in the normal group (P<0.05); and the expression of Cytokeratin and E-cadherin is significantly lower than those in the normal group (P<0.05); the expression of β-catenin in T3+T4 group is higher than T1+T2 group (P<0.05)，The expression of E-cadherinis significantly lower than T1+T2 Group (P<0.05). The expression of β-catenin is higher than the group without lymph node metastasis (P< 0.05). The expression of E-cadherin, Cytokeratin and is lower than the group without lymph node metastasis (P< 0.05). Conclusion EMT takes place in OSCC. E-codherin, Cytokeratin and β-catenin are differently expressed in OSCC and normal epithelial tissue. β-catenin may involve the progression of EMT in OSCC, promote infiltraton and metastasis of OSCC.

OSCC； β-catenin； E-cadherin； Cytokeratin； EMT； LNM

贵阳市卫生局科学技术计划项目 (2014筑卫科技合同字第15号); 贵州省科技计划课题任务(黔科合LG字[2011]001号)

R730.2

A

1000-744X(2016)03-0236-03

2015-12-06)

△通信作者，E-mail：hongchaof@126.com