USP22 aiRNA通过Mdm2-p53通路抑制膀胱癌耐药细胞株T24/MMC的增殖*

吕 磊， 袁敬东， 黄 韬， 吴 维， 黄遂斌， 章传华

武汉市第一医院泌尿外科，武汉 430022



USP22 aiRNA通过Mdm2-p53通路抑制膀胱癌耐药细胞株T24/MMC的增殖*

吕 磊， 袁敬东△， 黄 韬， 吴 维， 黄遂斌， 章传华

武汉市第一医院泌尿外科，武汉 430022

目的 研究沉默泛素特异肽酶22(USP22)基因对膀胱癌T24丝裂霉素C(mitomycin C，MMC)耐药细胞株(T24/MMC)生长活性的影响，并探讨其可能的作用机制。方法 采用MTT法检测不同浓度的MMC(20、40、80、160、320 μg/mL)对T24和T24/MMC细胞生长活性的影响。实时荧光定量PCR和Western blot法检测人膀胱上皮永生化细胞SV-HUC-1细胞株、T24和T24/MMC细胞中USP22 mRNA和蛋白的表达水平。采用非对称性小RNA(aiRNA)干扰技术沉默USP22，MTT法和吖啶橙/溴化乙啶(AO/EB)双重染色法分别检测沉默USP22后MMC对T24细胞、T24/MMC细胞生长活性和凋亡的影响。实时荧光定量PCR和Western blot法分别检测p53和Mdm2 mRNA和蛋白的表达水平。结果 采用不同浓度的MMC(20、40、80、160、320 μg/mL)处理细胞24 h后，T24细胞的生长活性分别为82.4%、68.7%、44.2%、25.4%和4.7%，与未经MMC处理组比较差异均具有统计学意义(均P<0.05)。然而，0～160 μg/mL的MMC对T24/MMC细胞的生长活性无明显影响。与SV-HUC-1细胞比较，USP22在T24及T24/MMC细胞中高表达，且T24/MMC细胞中USP22表达显著高于T24细胞，差异具有统计学意义(P<0.05)。沉默USP22后，MMC对T24细胞的生长活性抑制作用更显著。且当MMC浓度在20～160 μg/mL时，沉默USP22后T24/MMC细胞的生长活性也明显受到抑制，其生长活性分别为85.1%、70.3%、63.2%和47.8%。同时，AO/EB实验结果显示，沉默USP22后给予80 μg/mL的MMC处理24 h，可诱导T24及T24/MMC细胞凋亡。实时荧光定量PCR和Western blot结果进一步显示，转染USP22 aiRNA 24 h后，T24/MMC细胞中p53基因的mRNA和蛋白表达水平上调，Mdm2表达水平下调。结论 USP22 aiRNA通过调控Mdm2-p53通路增强MMC抑制T24细胞增殖的敏感性，同时也能够逆转T24/MMC对MMC的耐药。

膀胱肿瘤； 耐药； 泛素特异肽酶22； 细胞增殖； 基因表达调控

非肌层浸润性膀胱癌在经尿道膀胱肿瘤切除术(TUBRT)术后有很高的复发率，部分患者甚至进展为肌层浸润性膀胱癌[1]。术后行膀胱灌注化疗是预防非肌层浸润性膀胱癌术后复发和进展的重要手段。丝裂霉素为常见的膀胱灌注化疗药物之一，在我国临床应用广泛。由于膀胱癌具有起源多中心性，易复发、转移及耐药等生物学特性，部分患者长期行膀胱灌注化疗后出现对化疗药物抵抗，从而加速肿瘤的进展，导致癌症相关死亡[2]。因此，如何逆转膀胱肿瘤的化疗耐药成为膀胱癌临床治疗的关键问题。泛素特异肽酶22(USP22)基因是最近发现的泛素水解酶家族的一个新成员，被认为是癌致死标签，在肿瘤的发生发展中扮演者重要的角色[3]。前期研究发现，USP22在膀胱癌中异常高表达，与膀胱癌的复发、转移及耐药相关[4]。本文通过已建立的膀胱癌T24丝裂霉素C(mitomycin C，MMC)耐药细胞株(T24/MMC)，应用非对称小RNA(asymmetric structure of interfering RNA，aiRNA)干扰技术沉默USP22，观察其对T24/MMC细胞生长活性的影响，并探讨其潜在的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

RPMI 1640培养液、胎牛血清、0.25%胰酶购自美国Gibco公司；Trizol试剂、LipofectamineTM2000购自美国Invitrogen公司；逆转录试剂盒及实时荧光定量PCR试剂盒购自TaKaRa公司；MTT试剂盒、蛋白裂解液、BCA试剂盒和电化学发光(electrochemilum-inescence，ECL)试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；MMC购自浙江海正药业；凋亡检测试剂盒(AO/EB)购自南京凯基生物公司；兔抗人USP22、GAPDH多克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗购自美国Santa Cruz公司；Control aiRNA、USP22 aiRNA由上海吉玛公司合成及纯化；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2 细胞培养及转染

人膀胱癌细胞株T24、T24/MMC耐药细胞株和人膀胱上皮永生化细胞SV-HUC-1细胞株由本实验室保存。细胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液培养于5% CO2、37℃培养箱中。以6孔板为例，转染前1 d，用2 mL不含抗生素的培养液培养细胞，待细胞融合率达到50%～70%时进行转染。参考LipofectamineTM2000说明书进行转染，转染24 h后收集细胞进行下一步实验。根据实验方案进行分组：空白对照组(control)，转染非特异性aiRNA的阴性对照组(negative control aiRNA，NC aiRNA)，转染靶序列USP22 aiRNA组(USP22 aiRNA)。

1.3 USP22 aiRNA设计及合成

根据GenBank(NM_015276)中USP22基因序列和siRNA设计原则，先设计针对USP22基因的3条特异性siRNA靶序列，选取其中一条沉默效率最高的USP22 siRNA序列，在此序列基础上设计USP22 aiRNA序列，并设计阴性对照aiRNA(NC aiRNA)，具体设计方法参考前期研究结果[5]。

1.4 MTT法检测细胞生长活性

收集转染24 h后的T24、T24/MMC细胞，将细胞重悬，以5×103/孔接种于96孔板，100 μL/孔，各3个复孔，用不同浓度的MMC处理细胞，继续培养细胞24 h后，采用MTT法检测每孔的吸光度值(A值)，计算细胞增殖率。细胞增殖率=实验组A490 nm/空白对照组A490 nm×100%。

1.5 吖啶橙和嗅乙啶(AO/EB)双染色检测细胞凋亡

用0.25%胰酶+0.02%的EDTA消化处理后的T24、T24/MMC细胞，调整细胞密度为107个/mL，制备单细胞悬液。取100 μL细胞悬液，加入3 μL AO(100 μg/mL)和3 mL EB(100 μg/mL)。充分混匀后，置1滴于载玻片上，上覆盖玻片，荧光显微镜下观察结果并计数500个细胞。细胞凋亡率=凋亡细胞/所观察的细胞总数×100%。

1.6 实时荧光定量PCR检测目的基因mRNA的表达水平

收集处理后的各组细胞，采用Trizol两步法提取细胞的总RNA，以2 μg的总RNA为模板，使用Invitrogen逆转录试剂盒合成cDNA，实时定量PCR法检测目的基因的mRNA表达水平，GAPDH作为内参对照。USP22基因上游引物5′-GACAACTGGAAGCAGAACC-3′，下游引物5′-CGTACATCAGATCAATGGC-3′；p53基因上游引物5′-GCTGCTCAGATAGCGATGG-3′，下游引物5′-AGGACAGGCACAAACACG-3′；Mdm2基因上游引物5′-AAGAAGCAGTAGCAGTGAAT-3′，下游引物5′-GAAGTTGATGGCTGAGAATAG-3′；G-APDH上游引物5′-TGAAGGTCGGAGTCAAC-GG-3′，下游引物5′-CCTGGAAGATGGTGATGGG-3′。PCR扩增条件：95℃预变性2 min；95℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 30 s，35个循环；72℃延伸10 min。根据2-ΔΔCt方法计算目的基因mRNA的相对表达水平。

1.7 Western blot法检测目的基因蛋白的表达水平

收集处理后的各组细胞，裂解细胞提取细胞总蛋白。采用BCA法进行蛋白定量，取等量蛋白30 μg上样于12% SDS-PAGE胶。以120 V恒压电泳1 h，300 mA恒流转膜1 h。含5%脱脂奶的TBST室温封闭1 h，加入稀释一抗4℃封闭过夜；次日TBST洗膜10 min×3次，加入稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗，室温孵育1 h，TBST洗膜10 min×3次，ECL发光、X线胶片曝光、洗片。采用AlphaEaseFC 4.0图像分析软件进行定量分析，以目的基因/GAPDH条带吸光度比值代表目的蛋白的相对表达水平。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 不同浓度的MMC对T24、T24/MMC细胞生长活性的影响

采用不同浓度的MMC(20、40、80、160、320 μg/mL)处理细胞24 h，T24细胞的生长活性分别为82.4%、68.7%、44.2%、25.4%和4.7%，与未经MMC处理组比较差异均具有统计学意义(均P<0.05)。然而，当MMC浓度在0～160 μg/mL时，T24/MMC细胞的生长活性无明显差异(图1)。

与0 μg/mL MMC比较，*P<0.05图1 MMC对膀胱癌T24、T24/MMC细胞生长活性的影响Fig.1 Effect of MMC on the cell viability in bladder cancer T24 and T24/MMC cells

2.2 USP22 aiRNA对USP22基因表达水平的影响

实时荧光定量PCR和Western blot法检测结果(图2)显示，与SV-HUC-1比较，USP22在T24及T24/MMC中高表达，且T24/MMC中USP22表达显著高于T24细胞，差异具有统计学意义(P<0.05)。转染USP22 aiRNA后，T24及T24/MMC细胞中的USP22表达水平显著降低(图3)。

A：实时荧光定量PCR检测结果；B：Western blot法检测结果；与SV-HUC-1比较，*P<0.05；与T24比较， △P<0.05图2 实时荧光定量PCR和Western blot法检测USP22 mRNA和蛋白在SV-HUC-1、T24、T24/MMC细胞中的表达Fig.2 The expression levels of UPS22 mRNA and protein in SV-HUC-1，T24 and T24/MMC cells were determined by qRT-PCR and Western blotting，respectively

A、B：实时荧光定量PCR和Western blot法检测膀胱癌T24细胞中USP22 mRNA和蛋白表达水平；C、D：实时荧光定量PCR和Western blot法检测膀胱癌T24/MMC细胞中USP22 mRNA和蛋白表达水平；与空白对照组比较，*P<0.05图3 USP22 aiRNA对膀胱癌T24细胞和T24/MMC细胞中USP22 mRNA和蛋白表达水平的影响Fig.3 The effect of USP22 aiRNA on the USP22 mRNA and protein in T24 and T24/MMC cells

2.3 沉默USP22对MMC抑制T24和T24/MMC细胞生长活性的影响

MTT结果(图4)显示，与空白对照组、NC aiRNA比较，转染USP22 aiRNA后，MMC对T24细胞的生长活性抑制作用更显著。且当MMC浓度在20～160 μg/mL时，转染USP22 aiRNA后，T24/MMC细胞的生长活性也明显受到抑制。MMC浓度为20、40、80、160 μg/mL时T24/MMC细胞的生长活性分别为85.1%、70.3%、63.2%和47.8%。同时，AO/EB实验(图5)进一步显示，沉默USP22后给予80 μg/mL的MMC处理24 h，T24及T24/MMC的凋亡诱导增加，其细胞凋亡率分别为80.3%和34.5%。

2.4 USP22 aiRNA对p53和Mdm2 mRNA和蛋白表达的影响

如图6所示，与空白对照组、转染NC aiRNA组比较，转染USP22 aiRNA后给予MMC 80 μg/mL处理24 h，T24/MMC细胞的p53 mRNA和蛋白的表达水平显著上调，而Mdm2 mRNA和蛋白表达水平明显降低。说明沉默USP22逆转T24/MMC对MMC的耐药可能是通过下调Mdm2，上调p53的表达而实现的。

与空白对照组比较，*P<0.05图4 沉默USP22对膀胱癌T24细胞、T24/MMC细胞生长活性的影响Fig.4 Effect of silencing USP22 by USP22 aiRNA on the viability of bladder cancer T24 and T24/MMC cells

图5 沉默USP22后MMC对膀胱癌T24细胞和T24/MMC细胞凋亡的影响(AO/EB染色，×100)Fig.5 After silencing USP22 by USP22 aiRNA，the effect of MMC on the apoptosis of bladder cancer T24 and T24/MMC cells(AO/EB staining，×100)

A：实时荧光定量PCR检测结果；B：Western blot法检测结果；与空白对照组比较，*P<0.05图6 沉默USP22对膀胱癌T24/MMC细胞中p53和Mdm2表达水平的影响Fig.6 Effect of silencing USP22 by USP22 aiRNA on the mRNA and protein expression of p53 and Mdm2 in bladder cancer T24/MMC cells

3 讨论

MMC是膀胱癌术后行灌注化疗的常用药物，膀胱癌的化疗耐药是其治疗失败的主要原因。关于癌细胞在化疗过程中如何获得耐药性而逃避甚至抵抗化疗药物的攻击，国内外既往已有大量研究，部分学者认为肿瘤内P-糖蛋白过度表达，拓扑异构酶Ⅱ、细胞内谷胱甘肽转移酶含量变化等因素导致了肿瘤细胞耐药[6-7]，但其具体作用机制尚不明确。在肿瘤的化疗耐药形成过程中，可能涉及到多种基因的激活与表达。肿瘤干细胞是最近化疗耐药研究的热点，目前认为，这些具有自我更新、多方向分化潜能的干细胞，在肿瘤化疗耐药中扮演着重要的角色[8]。USP22是最近发现的一种潜在的干细胞标记物，也被称为“癌致死标签”，属于癌症死亡相关基因，与肿瘤的复发、转移、耐药密切相关。大量的研究证明，USP22在多种肿瘤组织中表达增高，并且发现异常高表达的USP22预示着肿瘤即将在体内扩散转移及出现化疗耐药[9]。目前，已研究发现USP22与DNA转录、Myc和p21介导的细胞增殖及细胞周期变化有着密切联系[10]。同时，USP22基因编码了一种与肿瘤相关的、能调控基因表达幅度变化的水解酶[11]。而且，USP22可与人转录复合物SAGA(human Spt-Ada-Gcn5-acetyltransferase)结合，乙酰化组蛋白H2A及H2B，激活下游基因的转录[12]。但到目前为止，USP22的生物功能尚未完全明确。本课题前期研究发现，USP22在膀胱癌组织中异常高表达，且与膀胱癌的病理分级、临床分期、转移复发及化疗耐药密切相关[4]。本实验通过实时荧光定量PCR和Western blot法检测发现，USP22在SV-HUC-1中微弱表达，而在T24及T24/MMC中高表达，且在T24/MMC中的表达显著高于T24细胞，进一步证实了前期的研究结果。同时，本研究将不同浓度的MMC作用于T24及T24/MMC细胞，结果显示，随着MMC浓度增加(0～320 μg/mL)，T24细胞的生长活性逐渐降低，且呈剂量依赖方式。然而，浓度低于160 μg/mL的MMC对T24/MMC细胞的生长活性却无明显影响，说明膀胱癌耐药细胞株T24/MMC对MMC具有耐药性。通过aiRNA沉默USP22后，增强了MMC诱导T24细胞凋亡的敏感性，同时也逆转了T24/MMC对MMC的耐药。本实验选择aiRNA而不是传统的siRNA沉默USP22基因的表达，是基于本课题组前期的研究成果，发现相对于siRNA，aiRNA不仅能够提高靶基因的沉默效率，同时也能够更有效地降低RNA干扰中“竞争效应”和“浓度饱和效应”的影响[13]。

进一步的研究发现，沉默USP22后，T24/MMC细胞中p53基因mRNA和蛋白表达水平显著上调，而Mdm2表达水平降低。p53是一个关键的肿瘤抑制蛋白，在人类肿瘤中也是最常见的突变基因。p53主要受转录后的调控，包括磷酸化、乙酰化、甲基化、泛素化、类泛素化等不同的修饰[14]。其中泛素化修饰是调控p53转录后水平的一个重要机制。p53可以被多种E3泛素连接酶修饰，包括Pirh2、ARF结合蛋白、Mdm2蛋白等。其中，Mdm2蛋白是p53基因的一个关键负调控因子[15]。Mdm2属于E3连接酶环指结构家族中的一员，环指结构可以结合E2泛素连接酶，从而将靶蛋白泛素化降解[16]。Stevenson等[17]研究发现USP2a通过Mdm2调控p53的表达，抑制内源性USP2a的表达使Mdm2表达不稳定，从而使p53蛋白聚集，促进p53的转录后激活。USP22与USP2a同属于泛素水解酶家族，在结构上两者也具有相似之处。因此，推测沉默USP22可能通过Mdm2上调p53基因的表达，抑制膀胱癌细胞的增殖和阻滞细胞周期的分布，逆转肿瘤细胞化疗耐药。

综上所述，本研究通过体外实验发现，沉默USP22可以通过调控Mdm2-p53信号通路增加MMC抑制T24细胞增殖及诱导凋亡的敏感性，同时也可以逆转T24/MMC耐药细胞株对MMC的耐药。靶向沉默USP22基因有望成为治疗化疗耐药性膀胱癌的一种新途径。

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(2016-03-24 收稿)

USP22 aiRNA Inhibits Proliferation of Drug-resistant Bladder Cancer Cell Line T24/MMC through Mdm2-p53 Signaling Pathway

Lv Lei，Yuan Jingdong△，Huang Taoetal

DepartmentofUrology，WuhanFirstHospital，Wuhan430022，China

Objective To investigate the effect of USP22 aiRNA on the proliferation of drug-resistant bladder cancer cell line T24/MMC，and to explore its underlying mechanism.Methods After treated by different concentrations of MMC(20，40，80，160，320 μg/mL)，the cell proliferation of T24 and T24/MMC was detected by MTT assay.The expression levels of USP22 mRNA and protein in SV40-immortalized human urothelial cells(SV-HUC-1)，T24 and T24/MMC cells were determined by using qRT-PCR and Western blotting，respectively.The expression of USP22 was inhibited by specific asymmetric structure of interfering RNA.The effect of USP22 aiRNA on cell proliferation of T24 and T24/MMC was detected by MTT assay and the cell apoptosis was detected by AO/EB assays.Moreover，after transfection with USP22 aiRNA，the mRNA and protein levels of p53 and Mdm2 were determined by qRT-PCR and Western blotting，respectively.Results After treated with different concentrations of MMC(20，40，80，160，320 μg/mL)，the cell viability of T24 cells was 82.4%，68.7%，44.2%，25.4% and 4.7%，respectively(P<0.05).However，MMC did not affect the cell proliferation of T24/MMC cells at 0-160 μg/mL(P>0.05).As compared with SV-HUC-1，the expression level of USP22 was up-regulated in T24 and T24/MMC cells.Moreover，the USP22 expression level of T24/MMC cells was higher than that of T24 cells.After silencing USP22 by USP22 aiRNA，the inhibitory effect of MMC on the cell proliferation in T24 cells was increased.Meanwhile，MMC significantly suppressed the viability of T24/MMC cells at 0-160 μg/mL(P<0.05).The cell viability of T24/MMC cells was 85.1%(20 μg/mL)，70.3%(40 μg/mL)，63.2%(80 μg/mL)and 47.8%(160 μg/mL)，respectively(P<0.05).The AO/EB result showed that silencing USP22 could sensitize T24/MMC to MMC-induced apoptosis.Furthermore，24 h after transfection with USP22 aiRNA，the mRNA and protein levels of p53 were increased，but the mRNA and protein levels of Mdm2 were reduced significantly(P<0.05).Conclusion USP22 aiRNA enhances the inhibitory effect of MMC on the proliferation in T24 cells and reverses drug resistance in MMC-resistant T24 cells.

bladder neoplasms； drug resistance； ubiquitin specific pepetidase 22； cell proliferation； gene expression regulation

*国家自然科学基金资助项目(No.81502204)；湖北省自然科学基金资助项目(No.2014CFB399)；湖北省卫生计生委科研资助项目(No.WJ2015MB136)

R737.14

10.3870/j.issn.1672-0741.2016.06.002

吕 磊，男，1981年生，主治医师，医学博士，E-mail：teecars@163.com

△通讯作者，Corresponding author，E-mail：YuanJD97@163.com