青蒿素对乳腺癌MT40的抑制作用及对CD71表达的影响

余和平， 崔 乐， 王必蓉， 潘跃进

武汉市普爱医院甲状腺乳腺外科，武汉 430033



青蒿素对乳腺癌MT40的抑制作用及对CD71表达的影响

余和平， 崔 乐， 王必蓉， 潘跃进

武汉市普爱医院甲状腺乳腺外科，武汉 430033

目的 探讨青蒿素对乳腺癌细胞MT40的抑制作用及对CD71表达的影响。方法 采用噻唑蓝(MTT)法检测不同浓度青蒿素对乳腺癌MT40细胞的增殖抑制作用，流式细胞仪检测其对CD71表达的影响。建立MT40荷瘤小鼠模型，分为阴性对照组、青蒿素实验组、阳性对照组，测量各组肿瘤体积并制作生长曲线，检测各组肿瘤组织的细胞凋亡率及CD71的表达。结果 不同浓度的青蒿素作用后，均对MT40细胞增殖产生了抑制作用，50、100、150、200 μmol/L青蒿素实验组细胞增殖抑制率分别为(16.32±0.12)%、(28.13±0.28)%、(44.36 ±0.23)%、(54.32 ±0.41)%，呈剂量依赖性；青蒿素作用后MT40细胞CD71表达受到抑制，50、100、150、200 μmol/L青蒿素实验组细胞CD71阳性表达率分别为(54.43±2.15)%、(46.32±2.14)%、(37.22±1.98)%、(30.75±2.87)%，100 μmol/L及以上浓度青蒿素可以明显抑制细胞CD71的表达(P<0.05)。与阴性对照组比较，青蒿素实验组、阳性对照组荷瘤鼠肿瘤生长均受到抑制(均P<0.05)；细胞凋亡率，青蒿素实验组为(21.23±4.56)%，阳性对照组为(17.42±1.23)%，阴性对照组为(1.22±0.33)%，青蒿素实验组与阴性对照组相比差异有统计学意义(t=8.193，P<0.05)，而与阳性对照组相比差异无统计学意义(t=1.140，P>0.05)；CD71表达阳性率，阴性对照组为(77.81±4.33)%，阳性对照组为(70.42±5.23)%，青蒿素实验组为(40.23±4.56)%，青蒿素实验组与阴性对照组相比差异有统计学意义(t=7.371，P<0.05)，与阳性对照组相比差异亦有统计学意义(t=5.338，P<0.05)。结论 青蒿素对乳腺癌细胞MT40具有显著抑制生长、诱导细胞凋亡作用，其机制可能与下调肿瘤组织CD71的表达有关。

青蒿素； 乳腺癌； CD71； 细胞凋亡

乳腺癌是女性发病率最高的恶性肿瘤，在乳腺癌综合治疗中，药物治疗占重要地位，临床广泛使用的化疗药物易产生显著的毒副作用及耐药性。青蒿素是由我国研制的抗疟药，具备抗疟效果突出、体内过程稳定、半哀期较短、消除较快、毒副作用小、价格低廉的特点，近年发现其具有抗多种肿瘤的作用及耐药逆转作用。本研究探讨青蒿素在体内外对小鼠乳腺癌MT40细胞的作用及与CD71表达的关系，以期为乳腺癌的治疗寻找新途径。

1 材料与方法

1.1 实验材料及仪器

昆明小鼠，4～6周龄，体质量(22±2)g，雌性，由江西省中医学院实验动物中心提供。主要实验材料：青蒿素(陕西汇生医药科技有限公司)，丝裂霉素(MMC，浙江海正药业股份有限公司)，高糖DMEM培养液(HYCLONE公司)，胎牛血清(FCS杭州四季青公司)，噻唑蓝(MTT，Amresco公司)，小鼠CD71一抗(BD公司)，乳腺癌MT40细胞株(本实验室液氮保存)，TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司)，CD71 ELISA试剂盒(BD公司)。主要仪器：倒置显微镜(重庆重光仪器公司)，LD4-2台式离心机(北京医用离心厂)，电热恒温水浴箱(北京长风仪器厂)，BB 16HF二氧化碳气体培养箱(香港力新仪器公司)，超净工作台(北京长城空气净化工程公司)，Multiskan Ascent全自动酶标仪(芬兰Thermo Labsysterms公司)，UFRO-01纯水装置(军事医学科学院卫生装备研究所)，流式细胞仪(FACS Calibur SE，美国BD公司)。

1.2 体外实验

1.2.1 实验分组 实验分3组：①阴性对照组，不加任何药物；②青蒿素组，分别加入不同浓度的青蒿素溶液，使其终浓度分别为50、100、150、200 μmol/L；③阳性对照组，加10 μmol/L丝裂霉素。

1.2.2 噻唑蓝(MTT)法检测乳腺癌MT40细胞生长 MT40细胞以含10%胎牛血清的DMEM培养液加双抗、37℃、饱和湿度、5%CO2条件下培养。2 d换培养液1次，胰蛋白酶消化、传代和收集细胞。将处于对数生长期的MT40细胞以5×104/mL密度加入96孔培养板，置于5%CO2的培养箱中培养12 h，按分组分别给予相应药物。继续培养16 h后，每孔加入MTT 20 μL(5 mg/mL)，温浴4 h，弃上清液，每孔加DMSO 150 μL，作用10 min并微振荡后，在酶标仪上检测490 nm波长吸光度值(A)。重复实验3次。按下列公式计算细胞生长抑制率：(1-实验组A值/对照组A值)×100%[1]。

1.2.3 流式细胞术检测MT40细胞中CD71的表达 将生长状态良好的MT40细胞接种于12孔培养板中，每孔细胞密度5×105/mL，加培养液至体积2 mL，培养12 h。按分组分别给予相应药物。继续培养16 h后消化，分别收集于离心管中(细胞密度达5×106/mL)，制备单细胞悬液，洗涤，固定，4℃过夜，CD71-PE染色、避光孵育30 min，上机检测。

1.3 动物实验

1.3.1 动物模型建立 传代培养MT40细胞，收集对数生长期细胞，以无菌生理盐水调整细胞密度至5×106/mL，制成细胞悬液，将MT40乳腺癌细胞悬液注入小鼠背部皮下，每只0.5 mL，待肿块长至直径0.8 cm左右时开始进行实验。本组动物实验模型肿瘤接种成功率为63.3%(19/30)。

1.3.2 实验分组 荷瘤鼠称重后随机分3组，每组6只。青蒿素实验组：青蒿素悬液150 mg/kg灌胃，每日2次，连续给药10 d；阴性对照组：喂服相同量生理盐水；阳性对照组：丝裂霉素3.0 mg/kg灌胃，每日2次，连续给药10 d。末次给药24 h后颈椎脱臼处死动物。

1.3.3 观察指标 ①肿瘤生长：每天测量瘤体最大径(A)、最小径(B)，计算肿瘤体积(V=1/2×A×B2)，制作肿瘤生长曲线；处死实验动物后剪开肿瘤部位，剥离瘤块，用滤纸吸净其上液体，测量瘤体质量。②肿瘤组织细胞凋亡率：肿瘤组织经过固定、洗涤、脱水、透明、透蜡、包埋、切片后，用TUNEL法检测细胞凋亡，操作步骤按试剂盒说明书进行，阳性为细胞核呈棕褐色的细胞，每张切片随机取5个高倍视野，每个视野计数100个细胞，计算阳性细胞百分比。③CD71检测：操作步骤按试剂盒说明书进行，用PBS替代第一抗体作为阴性对照。光镜下细胞膜呈黄色至棕色染色为阳性，细胞膜无色而细胞核蓝染为阴性。每张切片随机取5个高倍视野，每个视野计数100个细胞，计算阳性细胞百分比。

1.4 统计学方法

2 结 果

2.1 青蒿素对MT40细胞增殖的抑制作用

不同浓度的青蒿素作用后均对MT40细胞增殖产生了抑制作用(F=4 256.57，P<0.01)，在50～200 μmol/L浓度范围内，抑制作用随着青蒿素浓度的升高明显增强，见表1。

组别抑制率(%)50μmol/L青蒿素组16.32±0.12*100μmol/L青蒿素组28.13±0.28150μmol/L青蒿素组44.36±0.23*200μmol/L青蒿素组54.32±0.41*阳性对照组28.22±0.54

F=4 256.57，P<0.01；与阳性对照组比较，*P<0.05

2.2 青蒿素对MT40细胞CD71表达的抑制作用

流式细胞仪检测各组MT40细胞CD71表达见图1。各组CD71表达差异有统计学意义(F=17.56，P<0.01)。阴性对照组与阳性对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)；阴性对照组、阳性对照组与50 μmol/L青蒿素组相比差异均无统计学意义(P>0.05)，而与其他各青蒿素组相比差异均有统计学意义(P<0.05)；青蒿素各实验组两两比较，除了50 μmol/L与100 μmol/L组、150 μmol/L与200 μmol/L青蒿素组间比较差异无统计学意义(P>0.05)外，其他各组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。表明100 μmol/L及以上浓度青蒿素可以明显抑制细胞膜CD71的表达。见表2。

组别CD71表达率(%)阴性对照组62.92±2.48阳性对照组60.24±3.2450μmol/L青蒿素组54.43±2.15100μmol/L青蒿素组46.32±2.14*150μmol/L青蒿素组37.22±1.98*200μmol/L青蒿素组30.75±2.87*

F=17.56，P<0.01；与阳性对照组比较，*P<0.05

图1 各组细胞CD71表达的流式细胞图Fig.1 Detection of CD71 expression of each group by flow cytometry

2.3 青蒿素对移植瘤生长的抑制作用

在实验过程中，丝裂霉素阳性对照组荷瘤小鼠饮食量明显减少，且出现毛色粗糙灰暗等现象，而其他各组正常；各组荷瘤小鼠皮下移植肿瘤体积随时间延长继续增大，阴性对照组肿瘤体积增大明显，与阴性对照组相比，青蒿素实验组、阳性对照组荷瘤鼠肿瘤体积增长均受到抑制。各组最终瘤体体积为：阴性对照组(3.42±0.35)cm3，青蒿素实验组(2.09±0.31)cm3，阳性对照组(2.02±0.22)cm3，青蒿素实验组与阴性对照组比较差异有统计学意义(t=3.437，P<0.05)，青蒿素实验组与阳性对照组比较差异也有统计学意义，(t=3.493，P<0.05)。各实验组瘤体倍增时间为：阴性对照组2.77 d，青蒿素实验组3.45 d，阳性对照组3.44 d。肿瘤生长曲线见图2。

图2 各组肿瘤生长曲线图Fig.2 Tumor growth curve of each group

2.4 青蒿素对肿瘤组织细胞凋亡的诱导作用

凋亡细胞表现为细胞核固缩，细胞核变圆，TUNEL染色为细胞核染为棕黄色(见图3)。阴性对照组可见零星细胞凋亡，凋亡率为(1.22±0.33)%，青蒿素实验组、阳性对照组可见较多细胞凋亡，青蒿素实验组细胞凋亡率为(21.23±4.56)%，阳性对照组为(17.42±1.23)%，3组间比较差异有统计学意义(F=14.72，P<0.05)；青蒿素实验组与阴性对照组相比差异有统计学意义(t=8.193，P<0.05)，而与阳性对照组相比差异无统计学意义(t=1.140，P>0.05)。

图3 各实验组肿瘤组织凋亡(TUNEL染色，×400)Fig.3 Tumor cell apoptosis of each group(TUNEL staining，×400)

2.5 青蒿素对肿瘤组织CD71表达的抑制作用

CD71的表达主要分布在细胞膜，胞质内也有一定的表达(图4)。CD71表达阳性率，阴性对照组为(77.81±4.33)%，阳性对照组为(70.42±5.23)%，青蒿素实验组为(40.23±4.56)%，3组间比较差异有统计学意义(F=15.64，P<0.05)。青蒿素实验组与阴性对照组相比差异有统计学意义(t=7.371，P<0.05)，与阳性对照组相比差异也有统计学意义(t=5.338，P<0.05)。

图4 各实验组肿瘤组织CD71表达(免疫组化染色，×400)Fig.4 Tumor CD71 expression of each group(immunohistochemical staining，×400)

3 讨论

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，在我国占女性恶性肿瘤的7%～10%，其发病率还在逐年上升，严重威胁广大妇女的身心健康[1]。随着对乳腺癌生物学行为的深入研究，目前普遍认为乳腺癌是一种全身性疾病。手术治疗是乳腺癌治疗的重要方法，手术结果对判断预后有重要意义，手术治疗的发展趋势为手术范围逐渐缩小，术后综合辅助治疗加强[2]。在乳腺癌综合治疗中，药物治疗占重要地位，临床广泛使用的化疗药物易产生显著的毒副作用及耐药性，寻找对乳腺癌高效，低副作用的治疗方法具有重要意义。

青蒿素是我国科研工作者研制出的抗疟药，近年研究发现青蒿素对多种肿瘤细胞具有明显杀伤作用，对耐药性乳腺癌有耐药逆转作用[3-4]。其抗肿瘤的作用机制为药物与肿瘤细胞内铁离子结合，引起分子内过氧桥裂解产生活性自由基攻击红细胞内膜系统，发挥氧化、细胞周期延迟、抗肿瘤血管生成、致癌基因改变和肿瘤抑制基因表达以及多重耐药抗性作用，通过下调Bcl-2蛋白和上调Bax蛋白诱导细胞凋亡[5]。CD71为识别95 kD转铁蛋白受体(TfR)，是一种介导细胞内铁摄取和调节细胞生长相关的Ⅱ型跨膜糖蛋白，与转铁蛋白结合，主要表达于增殖细胞膜，介导细胞对铁的摄取[6]。在CD71介导下，铁被细胞摄取，促进DNA的合成、细胞增殖及细胞内电子呼吸链传递有序进行[7]，与无增殖活性细胞相比，增殖活跃的非肿瘤细胞和肿瘤细胞CD71的表达明显升高[8]。Leplletier等[9]研究表明，非何杰金瘤细胞CD71表达远高于正常B细胞。Dowlati等[10]研究显示，肺癌组织CD71的表达与组织分化程度密切相关，低分化者CD71呈高表达，高分化者CD71呈低表达。Gomme等[11]认为，CD71的表达与肿瘤基因被激活有关。大量研究表明，CD71在肿瘤细胞的表达与TNM分期、肿瘤分化程度、细胞异型程度及核分裂计数等密切相关，可反映肿瘤细胞的增殖状况，因此，降低肿瘤组织CD71的表达对肿瘤治疗有重要意义。丝裂霉素为抗肿瘤抗生素，其机制为与肿瘤细胞DNA交联反应产生抗肿瘤作用，已应用于临床多种肿瘤的治疗，也用于复发性乳腺癌的治疗。本研究也证实丝裂霉素对乳腺癌MT40细胞具有明显抑制作用。本研究发现，不同浓度青蒿素对乳腺癌MT40具有抑制细胞生长作用，与阳性对照组相比，50 μmol/L青蒿素组细胞增殖抑制率小于阳性对照组，100 μmol/L青蒿素组细胞增殖抑制率与阳性对照组相比，差异没有统计学意义，150 μmol/L及200 μmol/L青蒿素组细胞增殖抑制率大于阳性对照组，表明浓度越高，青蒿素对乳腺癌MT40细胞生长抑制作用越强。本研究还发现，青蒿素在抑制MT40细胞增殖同时，还明显降低MT40细胞CD71表达，在50～200 μmol/L浓度范围内，随着浓度的升高，降低CD71表达作用越明显，而丝裂霉素在抑制MT40细胞增殖作用同时，不具有降低MT40细胞CD71表达的作用，表明青蒿素对乳腺癌MT40细胞具有抑制增殖的同时，还具有改善临床预后的能力。从这个角度来看，青蒿素对乳腺癌MT40细胞作用优于丝裂霉素。

综上所述，青蒿素对乳腺癌MT40细胞在体外具有抑制细胞生长作用，呈剂量依赖性，在体内具有延长肿瘤倍增时间、抑制生长、诱导细胞凋亡作用，并且下调肿瘤细胞及组织CD71的表达。青蒿素对乳腺癌MT40的抗肿瘤作用具有重要临床意义，其可能通过下调肿瘤组织CD71的表达而发挥抑制肿瘤生长、诱导细胞凋亡作用，然而具体机制尚有待进一步研究。

[1] Panieri E.Breast cancer screening in developing countries[J].Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol，2012，26(2)：283-290.

[2] 沈镇宙，邵志敏.21世纪乳腺癌治疗的展望[J].中国癌症杂志，2005，15(5)：405-407.

[3] Posner G H，McRiner A J，Paik I H，et al.Anticancer and antimalarial efficacy and safety of artemisinin-derived trioxane dimers in rodents[J].J Med Chem，2004，47(5)：1299-2301.

[4] 余和平，崔乐，潘跃进.青蒿素对乳腺癌多药耐药MCF-7/ADR细胞的逆转作用[J].华中科技大学学报：医学版，2011，40(1)，91-94.

[5] Efferth T.Molecular pharmacology and pharmacogenomics of artemisinin and its derivatives in cancer cells[J].Curr Drug Targets，2006，7(4)：407-421.

[6] 张洪明.转铁蛋白受体的结构、表达及功能[J].实用临床医药杂志，2008，12(3)：114-117.

[7] Qian Z M，Li H，Sun H，et al.Targeted drug delivery via the transferring receptor-mediated endocytosis pathway[J].Pharmacol Rev，2002，54(4)：561-587.

[8] Daniels T R，Delgado T，Rodriguez J A，et al.The transferring receptor part 1：Biology and targeting with cytotoxic antibodies for the treatment of cancer[J].Clin Immunol，2006，121(2)：144-158.

[9] Leplletier Y，Camara-Clayette V，Jin H，et al.Prevention of mantle lymphoma tumor establishment by routing transferrin receptor toward lysosomal compartments[J].Cancer Res，2007，67(3)：1145-1154.

[10] Dowlati A，Loo M，Bury T，et al.Soluble and cell-associated transferring receptor in lung cancer[J].Cancer，1997，75(12)：1802-1806.

[11] Gomme P T，McCann K B，Bertolini J.Transferrin：structure，function and potential therapeutic actions[J].Drug Discov Today，2005，10(4)：267-273.

(2016-06-28 收稿)

Effect of Artemisinin on Breast Cancer MT40 and CD71 Expression

Yu Heping，Cui Le，Wang Birongetal

DepartmentofThyroid-BreastSurgery,WuhanPuaiHospital，Wuhan430033，China

Objective To study the effect of Artemisinin on MT40 cells and the expression of CD71invitroandinvivo.Methods MTT assay was undertaken to detect inhibition of Artemisinin at different concentration on MT40 cells.Flow cytometry was used to detect effect of Artemisinin on CD71 expression.MT40 tumor-bearing mouse model was established.The tumor-bearing mice were divided into 3 groups：negative control group，Artemisinin group and positive control group.Tumor volume was measured，and growth curve was plotted.Cell apoptosis rate and CD71 expression were determined.Results Artemisinin of different concentration inhibited the proliferation of MT40 cells.The inhibition rate was(16.32±0.12)%，(28.13±0.28)%，(44.36 ±0.23)% and(54.32 ±0.41)% respectively for 50，100，150 and 200 μmol/L Artemisinin；the inhibition was in a dose-dependent manner.The CD71 expression of MT40 cells was inhibited by Artemisinin in different concentration.The positive expression rate of CD71 was (54.43±2.15)%，(46.32±2.14)%，(37.22±1.98)% and (30.75±2.87)%，respectively for Artemisinin of 50，100，150，200 μmol/L.Artemisinin over 100 μmol/L significantly inhibited the expression of CD71 of MT40 cells(P<0.05).Compared with negative control group，tumor growth was significantly suppressed in Artemisinin group and positive control(bothP<0.05).Apoptosis rate was significantly higher in Artemisinin group[(21.23±4.56)%]than in negative control group [(1.22±0.33)%,t=8.193，P<0.05]，and it was not significantly different between Artemisinin group and positive control group [(17.42±1.23)%，t=1.140，P>0.05].CD71 positive expression rate was(77.81±4.33)% in negative control group，(70.42±5.23)% in positive control group，and(40.23±4.56)% in Artemisinin group，with significant differences between Artemisinin group and negative control group(t=7.371，P<0.05)，and between Artemisinin group and positive control group (t=5.338，P<0.05).Conclusion Artemisinin can significantly inhibit growth of MT40 cells and induce apoptosis，which might be related with down-regulation of CD71 expression in tumor tissues.

Artemisinin； breast cancer； CD71； apoptosis

R737.9

10.3870/j.issn.1672-0741.2016.06.006

余和平，男，1973年生，医学硕士，主治医师，E-mail：yuheping12@163.com.cn