沉默ski基因对大鼠星形胶质细胞迁移的影响

赵鑫，王兴文，寇江力，李忠浩，郭永强，伍亚民，张海鸿

·基础研究·

沉默ski基因对大鼠星形胶质细胞迁移的影响

赵鑫1,2，王兴文1,2，寇江力1,2，李忠浩1,2，郭永强1,2，伍亚民3，张海鸿1

目的研究ski基因在大鼠星形胶质细胞迁移过程中的作用。方法分离大鼠脑皮质星形胶质细胞，体外培养。合成ski基因和阴性对照小干扰片段。设置ski-siRNA转染组、阴性对照组和空白对照组。采用脂质体法将特异性针对ski基因的siRNA和阴性对照siRNA转入大鼠星形胶质细胞。采用Western blotting检测各组ski蛋白的表达水平；采用Transwell细胞迁移实验和细胞划痕实验检测ski-siRNA转染后星形胶质细胞迁移能力的变化。结果与空白对照组和阴性对照组比较，ski-siRNA转染组细胞内ski蛋白的相对表达水平显著降低(F=132.957,P＜0.001)。Transwell细胞迁移实验发现，ski-siRNA转染组每孔迁移细胞数少于空白对照组和阴性对照组(F＞47.197,P＜0.05)。细胞划痕实验显示，转染组细胞1～5 d的划痕愈合率均明显低于对照组(F＞69.187,P＜0.01)。结论沉默ski基因能显著抑制星形胶质细胞的迁移能力，ski可能参与星形胶质细胞的转移过程，进而调控胶质瘢痕的形成。

ski；RNA干扰；星形胶质细胞；Transwell细胞迁移实验；划痕实验；大鼠

[本文著录格式]赵鑫，王兴文，寇江力，等.沉默ski基因对大鼠星形胶质细胞迁移的影响[J].中国康复理论与实践,2017,23 (8):905-911.

CITED AS:Zhao X,Wang XW,Kou JL,et al.Effect of knocking down ski on migration of astrocytes in rats[J].Zhongguo Kangfu Li-lun Yu Shijian,2017,23(8):905-911.

星形胶质细胞是中枢神经系统(central nervous system,CNS)中数量最多、分布最广的胶质细胞，在维持CNS内环境稳定、营养支持神经元、CNS创伤后的功能修复等方面具有重要调节作用[1-3]。反应性星形胶质细胞增生早期可分泌某些神经元营养因子[4-5]，对维持和促进神经元的生长、发育、分化具有重要作用；但在晚期形成的胶质瘢痕可作为物理屏障，妨碍轴突的再生、延长[6-7]。胶质瘢痕的形成是影响CNS损伤功能恢复的重要因素，而胶质瘢痕的形成与星形胶质细胞迁移特性密不可分[8-9]，研究星形胶质细胞的迁移功能对CNS损伤后的功能恢复具有重要意义。

ski作为进化保守蛋白，在不同物种中广泛参与并调节多种细胞的增殖及分化等过程[10-11]。本课题组已明确ski在正常脊髓组织中表达很低，而在脊髓损伤后表达逐渐增高，推测ski可能作为新型信号分子影响星形胶质细胞的迁移，进而调节胶质瘢痕的形成[12-13]。基于这一假设，本实验采用RNA干扰技术，转染大鼠星形胶质细胞，观察ski对大鼠星形胶质细胞迁移及其相关蛋白的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂及来源

3日龄内的Sprague-Dawley大鼠，购于甘肃省中医药大学动物实验中心。

DMEM/F12培养基、胰蛋白酶：GIBCO。胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)：PAN-Biotech GmbH。TritionX-100、SDS、小鼠抗大鼠及兔抗大鼠胶质纤丝酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)多克隆抗体(G3893)：SIGMA。RIPA裂解液和BCA蛋白定量检测试剂盒：碧云天。兔抗大鼠ski多克隆抗体(H-329、sc-9140)：SANTA CRUZ。ski干扰RNA及阴性对照：THERMOFISHER公司合成。Lipofectamine®RNAiMAXReagent：THERMOFISHER。小鼠抗大鼠β-actin单克隆抗体：PROTEINTECH。山羊抗小鼠lgG、异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记山羊抗兔lgG、山羊封闭血清、PVDF膜(0.45 μm)：SOLARBIO。辣根过氧化物酶标记山羊抗兔或抗小鼠lgG：北京中杉金桥。ECL试剂盒：美国MILLOPORE。

本实验已经本院伦理委员会审批通过。

1.2 方法

1.2.1 原代大鼠星形胶质细胞的培养、纯化和鉴定

大鼠在75%酒精中浸泡消毒，-20℃冰箱冷冻麻醉5 min。采用无菌方法快速取出双侧大脑皮质，放入DMEM/F12液中，漂洗两遍。用眼科尖镊仔细剥离脑膜。把剥离好的脑皮质置于盛有胰酶的皿器中，剪碎脑皮质，用吸管轻柔吹打至组织块消散，置入37℃温箱辅助胰酶充分消化脑皮质3 min。将消化好的脑皮质移至15 ml离心管中，向离心管补加完全培养基3 ml，1500 r/min离心8min。弃上清液，再加入10%完全培养基(DMEM/FBS)4 ml，制成细胞悬液，将其移至培养瓶中。放入37℃、5%CO2培养箱中孵育。之后每隔3天换液，培养6～8 d，待细胞融合贴满瓶壁，封口后放入37℃恒温旋转摇床190 r/min，除去悬浮细胞和贴壁不牢的细胞，6 h后取出，进行传代培养即可获得纯化的星形胶质细胞。

采用GFAP多克隆抗体对纯化后的星形胶质细胞进行免疫细胞化学染色。在荧光显微镜200倍视野下随机选取6个互不重叠的视野进行纯度计数，计数GFAP阳性细胞数和总细胞数，阳性细胞数占总细胞数的百分数即为星形胶质细胞的纯度。纯度达到96%以上的星形胶质细胞符合本实验要求。

1.2.2 免疫荧光染色

将原代细胞接种到盖玻片上，贴壁后用PBS洗涤2遍，多聚甲醛固定30 min，PBS洗涤2遍，TritionX-100通透20 min，PBS洗涤2遍，滴加山羊封闭血清，37℃下封闭30 min，然后吸净封闭液，勿洗，加入小鼠抗大鼠GFAP多克隆抗体(1∶300)，玻片置于湿盒中，于4℃冰箱中孵育过夜。PBS洗涤2遍，避光下加山羊抗小鼠lgG(1∶300)，37℃温箱中避光孵育90 min，PBS洗涤2遍，避光下附加DAPI，室温孵育20 min，PBS洗涤2遍，甘油封片。荧光显微镜下观察。阴性对照用PBS代替一抗。

1.2.3 siRNA转染

将纯化的星形胶质细胞平均分为ski-siRNA转染组、阴性对照组和空白对照组。ski-siRNA转染组采用siRNA Lipofectamine®RNAiMAX Reagent将ski-siRNA转入星形胶质细胞；阴性对照组采用siRNA Lipofectamine®RNAiMAX Reagent将阴性对照-siRNA(negative control-siRNA,NC-siRNA)转入星形胶质细胞；空白对照组仅加入siRNA Lipofectamine®RNAiMAXReagent。ski-siRNA正义链的序列为5'-GCC CUG AUU CGA GAC AGC UUC UAC U-3'，反义链的序列为5'-AGU AGA AGC UGU CUC GAA UCA GGG C-3'；NC-siRNA正义链的序列为5'-UUG UGG CCU GUU AGC UUC AGA GCG A-3'，反义链的序列为5'-UCG CUC UGAAGC UAACAG GCCACAA-3'。

取对数生长期的星形胶质细胞接种于6孔板中，待细胞汇合度为80%时，进行siRNA转染，具体步骤依照siRNA转染试剂盒说明书提供的方法进行。待细胞转染72 h后，于倒置光学显微镜下观察细胞形态学的变化，随后提取细胞总蛋白，采用Western blotting法检测沉默效果。siRNA转染效率的检测：将FITC-control-siRNA(终浓度为100 nmol/L)6 μl与siRNA Lipofectamine®RNAiMAX Reagent 8 μl混匀后转染星形胶质细胞，12 h后在荧光显微镜下观察并计数出现绿色荧光的细胞数。

1.2.4 Western blotting

观察上述各组细胞生长情况，收集转染72 h后的各组细胞，用预冷的PBS清洗细胞2遍，用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，BCA试剂盒测定总蛋白浓度。提取的蛋白质行10%SDS-PAGE电泳(浓缩胶90 V、分离胶120 V)，将电泳分离好的蛋白电转至甲醇浸透好的PVDF膜上，采用5%脱脂奶粉室温封闭2 h，TBST(10 mmol/L Tris-HCl,pH7.5,150 mmol/L NaCl，0.5%Tween 20)洗涤10 min，共3次，加兔抗大鼠ski多克隆抗体(1∶100)、兔抗大鼠GFAP多克隆抗体(1∶2000)、小鼠抗大鼠β-actin单克隆抗体(1∶5000)，4℃冰箱中反应过夜；TBST洗膜(方法同前)；加辣根过氧化物标记的山羊抗兔或抗小鼠lgG(1∶5000)，室温下反应2 h；TBST洗膜3次(方法同前)；滴加ECL发光液，在GE凝胶成像系统中测量各目的条带的灰度值，以目的蛋白的灰度值与内参β-actin蛋白条带的灰度值之比代表目的蛋白的表达水平。

1.2.5 Transwell细胞迁移实验

采用胰蛋白酶消化并分别收集转染72 h后的ski-siRNA转染组、阴性对照组及空白对照组的星形胶质细胞，调整细胞密度为1×105/ml。上室中加入细胞悬液200 μl，下室加入含有10%胎牛血清的培养基500 μl。置于37℃、5%CO2的培养箱中培养24 h后取出小室，棉签拭去上室膜上未穿过小室膜的细胞，PBS清洗5 min，共3次，4%多聚甲醛溶液固定细胞30 min，风干后加入0.25%结晶紫染色10 min，PBS清洗3次，倒置光学显微镜下随机选取6个视野(放大倍数为200)计数迁移到下室的细胞数。

1.2.6 细胞划痕实验

实验操作前对所用物品进行灭菌，直尺和记号笔等物品操作前应在超净台内紫外线照射30 min。常规消化呈指数生长的星形胶质细胞，以5×105/孔接种至6孔板中，按前述转染方法将细胞分为转染组和对照组。待细胞贴壁密度达到80%时将6孔板放置在预先设计好的划痕模版(模版上均匀划6条横线，线间距离1 cm)上，借助直尺，采用200 μl移液枪头在板底依照模版在对应孔中划直线，用PBS漂洗2次以除去划下的悬浮细胞，继续培养相应时间(1 d、2 d、3 d、4 d、5 d)后在倒置光学显微镜下观察细胞迁移情况。用Image-Pro Plus 6.0软件测各个时间点细胞未覆盖的面积。

1.3 统计学分析

采用SPSS 21.0软件进行统计分析。每组数据来自3次独立的实验，以(xˉ±s)表示，采用单因素方差分析(One-wayANOVA)。显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 体外培养星形胶质细胞形态及纯度鉴定

星形胶质细胞的胞核呈圆形或椭圆形。星形胶质细胞纯度为96%(n=5)。特异性标记抗原GFAP为红色荧光，DAPI标记细胞核为蓝色荧光。见图1。

2.2 转染后细胞形态观察

未转染的星形胶质细胞均贴壁生长，呈铺路石状，可见细胞轮廓清晰，突起较多，且胞突之间有交叉连接，胞体多数呈星状或不规则状，细胞核清晰可见，呈圆形或椭圆形，核仁明显可见，细胞胞膜完整(图2a)；转染ski-siRNA72 h后，可见星形胶质细胞体积较转染前有所增大，胞突增粗，但细胞集落减少，未贴壁细胞增多，细胞碎片增多(图2b)。转染FITC-control-siRNA后星形胶质细胞中出现FITC绿色荧光，转染效率为(82.78±3.78)%。见图2c。

2.3 ski蛋白

Western blotting结果显示，与空白对照组和阴性对照组比较，ski-siRNA转染组细胞内ski蛋白的相对表达水平显著降低(P＜0.001)；而阴性对照组与空白对照组相比无显著性差异(P＞0.05)。见表1、图3。

2.4 GFAP

与空白对照组和阴性对照组相比，ski-siRNA转染组细胞中GFAP的表达水平明显下调(P＜0.01)。见表2、图4。

2.5 星形胶质细胞迁移能力

ski-siRNA转染组每孔迁移细胞数均明显少于空白对照组和阴性对照组(P＜0.01)，空白对照组与阴性对照组间无显著性差异(P＞0.05)。见表3、图5。

细胞培养1～5 d，转染ski-siRNA组细胞划痕愈合率均明显小于对照组(P＜0.01)。见表4、图6。

3 讨论

ski基因是Stavnezer等[14]于1986年首次在感染病毒Bratislava77的鸡胚细胞中发现的。研究表明ski与多种细胞的增殖、分化、转化及肿瘤发生发展相关[15-17]。目前关于ski分子的调控研究主要集中在胚胎发育、组织创伤修复及对肿瘤细胞发生发展的调节等方面[16,18]。本研究组前期实验首次证实，ski在星形胶质细胞生物学功能方面起到一定的作用[2]。

CNS正常结构和功能的维持离不开胶质细胞，而星形胶质细胞作为CNS中数量最多、分布最广的胶质细胞[2]，其对神经递质调节、内环境稳态、血脑屏障的维持起着重要的作用。CNS损伤后，星形胶质细胞作为主要的胶质细胞参与CNS损伤后的病理生理过程，其最具特征性的表现是反应性星形胶质细胞增生(reactive astrogliosis,RA)[19-20]，RA又表现为神经GFAP表达上调[1,21]。而严重的胶质细胞增生不仅出现GFAP上调及胞体肥大增生等表现，还可以见到致密胶质瘢痕形成[19]。以往研究表明，胶质瘢痕的形成会阻止轴突的再生，进而妨碍CNS损伤后神经功能恢复；但近几年有研究表明[22-24]，胶质瘢痕的形成不但可以加快损伤的神经组织愈合，还可以作为一道物理屏障限制损伤局部炎症的进一步扩散，避免损伤周围组织的损伤。由此可见，RA对CNS损伤既是不利因素又有保护作用。因此，深入探讨调控胶质瘢痕形成的分子机制，以保存或放大RA的有利作用，同时减低其不利作用至关重要。

本实验利用脂质体转染法将ski-siRNA转染至大鼠星形胶质细胞中抑制ski的表达，初步探讨沉默ski基因表达对星形胶质细胞迁移特性的影响。本研究结果显示，转染ski-siRNA后成功抑制星形胶质细胞中ski蛋白的表达以及细胞迁移能力，证明ski在促进星形胶质细胞迁移特性方面起到重要调控作用。

本研究还发现，ski-siRNA转染组细胞中GFAP表达水平与ski的表达水平同时下调。GFAP作为星形胶质细胞特有标志蛋白[25]，参与星形胶质细胞生物学活性的调节[21]。已有研究报道[26-27]，GFAP与星形胶质细胞迁移能力呈正相关，而本研究发现在ski基因表达沉默后，GFAP表达量也相应下降，因此细胞迁移能力下降可能与此有关。但抑制ski表达后是否还会抑制一些其他迁移相关蛋白的表达，如基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP2)[28]、整合素[29]等，进而调节星形胶质细胞的迁移及侵袭能力，还需进一步研究。

以上实验结果证明，采用ski-siRNA可以成功沉默ski基因表达，沉默ski基因后的星形胶质细胞迁移能力明显受抑制。由此，我们推测ski可能调控胶质瘢痕的生成过程，但其具体分子机制有待于进一步研究证实。深入研究ski对星形胶质细胞生物学功能的作用，可为CNS损伤后神经功能的康复提出一条新的途径。

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Effect of Knocking Down ski on Migration ofAstrocytes in Rats

ZHAO Xin1,2,WANG Xing-wen1,2,KOU Jiang-li1,2,LI Zhong-hao1,2,GUO Yong-qiang1,2,WU Ya-min3,ZHANG Hai-hong1
1.Department of Orthopedics,Second Clinical Medical College of Lanzhou University,Lanzhou,Gansu 730030, China;2.Key Laboratory of Orthopedics of Gansu Province,Lanzhou,Gansu 730030,China;3.State Key Laboratory of Trauma,Burns and Combined Injury,the Third Department of Research Institute of Surgery,Daping Hospital,Third Military University,Chongqing 400042,China

ZHANG Hai-hong.E-mail:zhanghaihong1968@sina.com

ObjectiveTo investigate the effect of ski gene in migration process of astrocytes in rats.Methods Astrocytes were obtained from rats'cerebral cortex and cultured in vitro.siRNA targeting ski gene and negative control sequences were prepared.The ski-siRNA group,siRNA negative control group and untreated group were set in this experiment.The specific siRNA targeting ski gene was transfected into astrocytes with Lipofectamine®RNAiMAX Reagent.Then the ski protein levels were determined with Western blotting.After transfection,the changes in migration of astrocytes were measured with wound scratch assay and Transwell migration assay.Results Western blotting showed that the expression of ski protein was significantly lower in the ski-siRNA group than in the siRNA negative control group and untreated group(F=132.957,P＜0.001).Transwell migration assay showed that the number of astrocytes crossing through chambers was less in the ski-siRNA group than in the siRNA negative control group and untreated group(F＞47.197,P＜0.05).Wound scratch assay showed that the wound healing rate was lower in the ski-siRNA group than in the control group one,two,three,four and five days after transfection (F＞69.187,P＜0.001).Conclusion Ski knocked down by siRNA could inhibit the migration ability of astrocytes.It is a reminding that ski may take part in the migration process of astrocytes,and moreover,ski may play an important role in the formation of glial scar.

ski;siRNA;astrocyte;Transwell migration assay;wound scratch assay;rats

R364.5

A

1006-9771(2017)08-0905-07

2017-04-10

2017-05-05)

10.3969/j.issn.1006-9771.2017.08.008

1.国家自然科学基金项目(No.30772299)；2.兰州大学第二医院科研基金项目(No.sdkyjj-04)。

1.兰州大学第二医院骨科，甘肃兰州市730030；2.甘肃省骨关节疾病研究重点实验室，甘肃兰州市730030；3.第三军医大学大坪医院野战外科研究所三室，创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室，重庆市400042。作者简介：赵鑫(1991-)，男，汉族，山东潍坊市人，硕士研究生，主要研究方向：脊柱脊髓损伤。通讯作者：张海鸿，主任医师，副教授，硕士研究生导师，主要研究方向：脊柱外科。E-mail:zhanghaihong1968@sina.com。