自噬在多柔比星所致心脏毒性中的作用研究进展

张 升，杨 林，2，由振强，辛艳飞

（1.浙江省医学科学院安全性评价研究中心，浙江杭州 310013；2.浙江工业大学长三角绿色制药协同创新中心，浙江杭州 310014）

多柔比星（doxorubicin）是临床上广泛使用的一种广谱高效的蒽环类抗肿瘤药物，但因其具有心脏毒性而在临床应用中受到限制。多柔比星致心脏毒性的机制尚不完全清楚，通常认为与心肌细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）增加、线粒体损伤和细胞凋亡等机制相关［1］。细胞自噬是一类依赖于溶酶体的蛋白质降解途径。研究表明，自噬在多柔比星所致心脏毒性中具有重要作用，自噬既可能对一些心肌病变具有一定的保护作用，也可能使一些心肌损伤更加恶化［2］。本文回顾多柔比星对自噬的影响及自噬在多柔比星心肌毒性中的作用。

1 多柔比星心脏毒性机制

多柔比星在临床上广泛用于肺癌、乳腺癌、实体瘤和白血病等多种恶性肿瘤化疗。心脏毒性是其主要副作用之一［1-2］。成人临床应用的回顾性分析显示，多柔比星累积给药剂量为400 mg·m-2时，充血性心力衰竭的发生率为3%～5%，700 mg·m-2时提高至18%～48%。不仅如此，多柔比星所致的心脏毒性作用存在预后差和致死的严重后果，比例高达61%［3］。

通常认为多柔比星的心脏毒性机制主要包括以下几个方面：①多柔比星在体内代谢过程中生成大量的ROS和活性氮（reactive nitrogen species，RNS），包括·OH，O2∸，H2O2和ONOO-等，而心肌细胞的过氧化物酶活性偏低，从而显示明显的心脏毒性［4］。②多柔比星引起心磷脂过氧化，呼吸链解偶联，引发心肌线粒体代谢失常，导致细胞凋亡［5］。③多柔比星可使细胞内Bcl-2/Bax的比值下降，随之线粒体内细胞色素c释放，致使细胞凋亡［6］。④在心肌细胞中高表达的拓扑异构酶2和多柔比星以及DNA形成复合体，引起双链断裂，导致心肌细胞死亡［7-9］。⑤多柔比星诱导体内一氧化氮合酶表达，一氧化氮浓度的升高使心肌的功能酶（如肌原纤维肌酐激酶等）硝化失活，使心肌受损［10］。⑥在病理状态下，自噬既可能对一些心肌病变具有一定的保护作用，也可能使一些心肌损伤更加恶化［2］。

2 自噬概述

自噬是细胞自身将一些蛋白质和细胞器包裹在特定膜的结构中，然后送入溶酶体（或液泡）降解的过程，在细胞内表现为双层膜结构将待降解蛋白复合物、受损伤细胞器及入侵的病原体等包裹、运送到溶酶体，被溶酶体酸性水解酶降解消化，维持着细胞的自我稳态［11-12］。自噬按形成方式通常分为3种，即巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬。巨自噬的特征是有独特的双层膜结构——自噬体形成，自噬体包被胞质成分，如蛋白质聚集体，损伤或衰老的线粒体和过氧化物酶体等，最终与溶酶体融合。微自噬则是溶酶体内陷，包裹部分胞质进入溶酶体，无独立的双层膜自噬体形成。而分子伴侣介导的自噬则是由特定蛋白HSC70等介导，具有选择性［13］。另外，根据自噬的选择性，又可以分为线粒体自噬和过氧化物酶体自噬等。多数学者认为，自噬是细胞的一种防御和调控机制，细胞在应答环境胁迫压力下，会引起自噬上调，通过自噬泡包裹和消化，降解成核苷、氨基酸和脂肪酸等小分子重新循环利用，合成新的大分子和ATP，从而维持细胞的正常代谢和生存［2］。

3 自噬在多柔比星所致心脏毒性中的作用

3.1 线粒体自噬在多柔比星所致心肌毒性中的作用

多柔比星暴露可导致心肌细胞中ROS大量生成、线粒体受损及凋亡蛋白的表达释放。心肌细胞中，线粒体不仅提供ATP，而且存储ROS，当线粒体受到损伤，线粒体中的ROS将释放到胞浆中，损伤细胞核或各细胞器，诱导细胞氧化应激。因此，及时清除受损线粒体能使心肌细胞内ROS减少，增加心肌细胞的抗氧化能力。氧化应激的增加进一步加重了心肌细胞中DNA损伤和线粒体功能障碍，致使ROS生成进一步增加［1］。因此，在心肌细胞中，清除受损线粒体的线粒体自噬尤显重要。心肌细胞中的线粒体自噬主要有2条通路，即PINK1/Parkin通路和Bnip3/Nix通路。

PINK1在线粒体自噬中发挥重要功能。研究发现，当线粒体功能缺失或线粒体膜发生改变时，线粒体膜表面将聚集大量的PINK1，PINK1通过产生磷酸化的泛素直接激活线粒体自噬，或激活E3样泛素连接酶Parkin，进而使线粒体膜表面蛋白被自噬双层膜结构识别，包裹形成自噬小体，诱导自噬产生［14-15］。更有研究显示，在多柔比星心脏毒性中，Parkin和PINK1表达水平可作为线粒体自噬水平的指标［16］。在该研究中，给予小鼠多柔比星5 d后，PINK1或Parkin表达水平显著降低，提示Parkin介导的线粒体自噬水平的降低。多柔比星暴露2周后，PINK1/Parkin蛋白表达恢复至初始甚至更高的水平。另有研究表明，具有抑制线粒体分裂和线粒体自噬的多肽mdivi-1可以有效缓解多柔比星引起的心肌损伤，说明过度的线粒体自噬会加重多柔比星的心脏毒性［17］。

BNIP3和Nix均为哺乳动物线粒体自噬受体，不需要经过线粒体表面的泛素化修饰，可以通过其微管相关蛋白1轻链3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）相互作用模体（LC3 interacting region，LIR）结构与微管LC3相互作用而诱导线粒体自噬的发生。研究表明，多柔比星诱导的线粒体呼吸链损伤及细胞死亡与BNIP3基因的激活密切相关。鞣花酸可通过抑制BNIP3活性减轻多柔比星所致的线粒体损伤和心肌细胞坏死［18-19］。

3.2 自噬在多柔比星所致心脏毒性中的调节机制

自噬在多柔比星心脏毒性中的作用机制尚不完全明确，通常认为多柔比星可以通过干扰上游通路如哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）和腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）等来调控自噬，但多柔比星激活还是抑制自噬有一定分歧。研究认为，多柔比星对机体自噬水平的影响（激活或抑制）与多柔比星的剂量和暴露时间相关，与动物模型或研究对象的性别、年龄甚至昼夜节律都存在一定的联系。有研究表明，在多柔比星暴露前，自噬水平的升高有助于缓解多柔比星所致心脏毒性；而在多柔比星暴露后，抑制自噬的启动或自噬小体形成则具备心肌损伤保护功能［5］。

AMPK是哺乳动物细胞中高度保守的蛋白质。当细胞内能量下降时，肝激酶B1（liver kinase B1,LKB 1)可磷酸化激活AMPK，活化的AMPK则可以通过抑制mTOR诱导自噬，进而增加Unc-51样激酶（Unc-51 like kinase，ULK1）磷酸化和活化ULK1。Kawaguchi等［20］证实，在多柔比星所致急性心肌损伤小鼠模型中，多柔比星引起AMPK的失活，ULK1去磷酸化，进而降低自噬水平。而小鼠在给予多柔比星前禁食，可以提高其体内的自噬水平，进而有效拮抗多柔比星所致的心脏毒性。

认为多柔比星增加自噬作用的研究表明，多柔比星可通过多种机制激活自噬。大量研究表明，多柔比星可以抑制模型动物体内的mTOR，进而导致心肌细胞损伤，而多柔比星对mTOR的抑制与P53的上调相关［21-22］。Chen等［23］报道了另一条与P53抑制GATA-4相关的多柔比星激活自噬通路。通常Bcl-2和Beclin1结合，阻止Beclin1和VPS34作用而引发自噬。多柔比星可以通过P53通路，抑制转录因子GATA-4，使Bcl-2下调，而GATA-4和Bcl-2的下调则激活自噬。另有研究认为，多柔比星可能因为引起Atg5和Atg12等自噬相关蛋白的表达增加，进而激活自噬［24］。白藜芦醇则通过抑制S6K1拮抗多柔比星引起的自噬激活，从而增加心肌细胞存活率［24］。利用多柔比星大鼠心脏毒性模型，研究人员发现，磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-hy-droxy kinase，PI3K）参与了巨自噬的启动和成核过程。应用3-Methyladenine抑制PI3K，可以抑制自噬体的形成，改善多柔比星导致的大鼠心脏功能下降［25］。

多柔比星激活还是抑制自噬以及自噬对心脏功能的影响均存在一定的分歧。有研究者认为，多柔比星不仅影响自噬体起始和发展阶段的分子通路，同样影响溶酶体融合和功能的分子通路。研究发现，从H9C2细胞内p62水平的增加可以反映出多柔比星引起了巨自噬的下调，但p62水平的增加并未伴随LC3-Ⅱ/Ⅰ比值的变化。说明多柔比星不仅影响了自噬通路的上游过程，也影响溶酶体的自噬流，而后者可能在多柔比星所致的心肌功能异常中具有更加重要的功能［26］。

4 结语

细胞自噬和凋亡通过Beclin1、Atg5和线粒体信号通路等紧密联系，如Atg5和Atg12可以直接抑制Bcl-2家族，调节细胞色素c从线粒体的释放，从而可激活胱天蛋白酶9，导致凋亡。也有研究认为，自噬体可以为凋亡蛋白（如胱天蛋白酶8等）提供活化的平台，进而引起细胞凋亡。事实上，细胞自噬和凋亡之间的关系较为复杂，并不像多数研究描述的那样：自噬紊乱引起了细胞的凋亡，而简单拮抗这种自噬的失衡就可以有效的提高细胞存活率［27］。

自噬在生命体内存在双重作用。正常生理条件下，自噬引起的细胞死亡被证实是人类心衰的主要原因［2］。多柔比星如何干扰心肌细胞自噬，以及多柔比星心肌自噬与线粒体及细胞核毒性之间的关系尚未完全清楚。同样，对增加或抑制自噬是否是多柔比星心脏毒性的主要原因还存有巨大争议。深入了解多柔比星心脏毒性中的自噬过程，有助于预防和治疗多柔比星导致心肌病变的发生。

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