猪病毒病病毒样颗粒疫苗研究进展

于新友 ，李天芝 ，李 峰

（1.山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 256600；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600）

病毒样颗粒(Virus like particles，VLPs)是由病毒的一种或多种结构蛋白在异源系统内重组表达，并在该系统内或系统外自动装配成的一种不含病毒核酸的高度结构化空心颗粒[1]。VLPs大小介于15～400 nm之间[2]，形态上类似于真正的病毒粒子，不含病毒核酸，无法复制和扩增，因此，不具有感染性，安全性好[3]。VLPs保留了天然病毒粒子的空间构象和诱导中和抗体的抗原表位，免疫原性强，可模拟病毒感染途径，被呈递给免疫细胞，激发机体细胞免疫、体液免疫及黏膜免疫等免疫应答。VLPs具有病原体相关模式分子的活性，也可激活固有免疫应答。VLPs疫苗作为一种新型的亚单位疫苗，具有稳定性高、免疫原性好、安全性高[4]、适宜大规模生产等优点。与传统疫苗相比，VLPs具有相当的免疫原性和更好的安全性而成为一种理想的疫苗形式，自从出现后就受到了人们的普遍重视，VLPs在结构上允许外源基因或基因片段的插入而形成嵌合型VLPs并将外源性抗原展示在其表面。此外，多数病毒VLPs还具有包裹核酸或其他小分子的能力，可作为基因或药物的运载工具[5、6]，是研制安全高效的预防病毒性疾病的潜在候选疫苗。迄今为止，国内外针对VLPs进行了大量的研究，本文就VLPs在猪病毒病防治应用方面的研究进行综述，以期为猪病毒病的防控工作提供新的思路。

1 VLPs的免疫机制

与其他亚单位疫苗和重组蛋白疫苗相比，VLPs的免疫原性更强，可诱导机体产生体液免疫应答反应，主要是VLPs的抗原表位与天然病毒类似，并高度模仿了天然病毒的空间构象，表面有可被B淋巴细胞表面受体识别的成分，活化B淋巴细胞，上调组织相容性复合体MHCⅡ类分子水平，刺激机体产生特异性中和抗体，从而诱发免疫反应。外源的VLPs也能通过交叉提呈的方式，通过MHC-Ⅰ类途径进行提呈，从而活化CD8 T细胞，实现CD8细胞介导的保护性免疫反应，这对于清除细胞内的病原体如病毒等至关重要。因在递呈给树突状细胞加工、被MHCⅡ类分子展示以及直接引起树突状细胞成熟和迁移的过程中，VLPs的大小适合被树突状细胞(DCs)通过吞噬、渗透及Toll样受体（TLR受体）介导等方式高效摄取，所以具有一定的免疫佐剂分子效应，单独免疫动物就能诱导机体产生较强的免疫应答反应。VLPs能模拟天然病毒的体内感染过程，从而激活抗原递呈细胞，尤其是进入树突状细胞（DCs）后，能上调DCs的数量并促进其成熟，使其细胞表面分子如CD40、CD80、CD86及 MHC- Ⅰ 和Ⅱ类分子表达水平明显上调，同时促进DCs分 泌 IL-6、IL-10、MIP-1α 及TNF-α等细胞因子，从而诱导机体产生细胞免疫应答。

2 猪病毒病病毒样颗粒疫苗研究进展

2.1 猪圆环病毒病

猪圆环病毒2型（PCV2）是引起仔猪断奶后多系统衰竭综合征的主要病原，此外，PCV2还与猪呼吸道综合征、猪皮炎与肾炎综合征和繁殖障碍以及肠炎等疾病有关，是一种免疫抑制性疾病，给世界养猪业造成严重的经济损失[7]。赵晓云等[8]根据大肠杆菌密码子使用频率表优化合成PCV2 NJ株ORF2基因，将其插入原核表达载体pQZ1，鉴定阳性后转入表达宿主菌BL21，对重组菌进行诱导表达。SDS-PAGE结果表明PCV2 NJ株优化的ORF2基因在大肠杆菌中得到了高效表达，表达产物以完全可溶性形式存在于菌体超声波破碎后的上清液中，Western-blotting分析结果显示，表达的重组Cap蛋白能够与PCV2阳性血清发生反应，电镜观察，可见大量直径在17 nm左右的PCV2 VLPs存在于超声破碎后的上清液中，500μg/头重组VLPs疫苗免疫猪产生较高的抗体水平，单次免疫后21 d抗体100%达到合格，对PCV2强毒的攻击提供完全保护。Chi等[9]采用同源重组技术构建了含PCV2的Cap基因的重组PRV病毒株gE(-)/PCV2cap(+)PRV。通过间接免疫荧光试验(IFA)和Westernblotting方法证实重组病毒复制过程中可表达Cap蛋白。电子显微镜结果显示，所表达的Cap蛋白能组装成VLPs。用纯化的VLPs免疫小鼠和豚鼠可产生针对PCV2 Cap的特异性免疫应答。

2.2 猪口蹄疫

口蹄疫(FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的偶蹄动物常发的一种烈性传染病，猪口蹄疫临床表现主要为蹄冠、趾间、蹄踵皮肤发生水泡和烂斑，部分猪口腔黏膜和鼻盘也有同样病变。潘群兴等[10]将O型FMDV VP1中编码T细胞表位肽(aa21-aa40)序列连接于PPV VP2的5’端，并插入到杆状病毒供体质粒pFastBacHTA中，构建成重组转座载体pFastBac-FMDVVP1-PPV-VP2，转化含有穿梭载体Bacmid的大肠杆菌感受态DH10Bac中，经蓝白菌落筛选获得重组杆状病毒表达质粒rBac-FMDV-VP1-PPVVP2，转染昆虫草地夜蛾细胞(Sf9)，并在Sf9中进行了表达。电镜观察显示，表达的重组蛋白能自我组装成病毒样颗粒，用IFA、Western-blotting分析表明，表达产物具有与PPV VP2天然蛋白相似的免疫原性。小鼠免疫实验证实，在低浓度FMDV抗原下能够产生特异性T淋巴细胞增殖反应，而且该病毒样颗粒能诱导机体产生抗FMDV特异性细胞免疫反应。董艳美等[11]根据猪源FMDV VP1上第141-160位氨基酸序列设计引物，利用重叠延伸PCR技术将该序列插入在大肠杆菌噬菌体MS2外壳蛋白基因的特定位点。然后连接到原核表达载体pET28a上，构建了重组表达质粒28a-CPVP1，转化BL21，ITPG诱导表达得到融合表达的CP-VP1蛋白，透射电子显微镜下观察融合蛋白CP-VP1成类VLPs状。间接ELISA试验证实该蛋白能够特异地结合豚鼠抗O型FMDV的阳性血清，30 μg的 CP-VP1的VLPs蛋白免疫小鼠后，可以诱导其产生高效价的特异抗体。窦小龙等[12]为制备Asia 1型FMDV双层结构病毒样颗粒，选择牛病毒性腹泻病毒(BVDV)流行株核心蛋白p14的第169-270位氨基酸FMDVAsia1/JS/CHA/05结构蛋白VP1的第1-211位氨基酸，两者之间设计柔性肽连接，人工合成p14-柔性肽-VP1融合蛋白编码序列，全基因长990 bp。合成基因与枯草芽胞杆菌表达载体p7257-P43连接，构建成表达质粒p7257-P43-P14-VP1。转化枯草芽胞杆菌WB800，经筛选、鉴定，获得表达p14-VP1融合蛋白的枯草芽胞杆菌。该重组表达菌在含有40μg/mL氯霉素的LB中培养后，菌体超声破碎可检测到目的蛋白。Western-blotting结果显示，该蛋白能特异性识别Asia 1型FMDV抗体，具有良好的反应原性。电镜观察显示，融合蛋白组装为直径约50 nm大小的VLPs。盛蓉等[13]以兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白VP60为载体，分别在RHDV衣壳蛋白的C端、N端、306和307位氨基酸之间插入FMDV B细胞表位(VP1 200-213aa)，得到嵌合VP60基因。利用杆状病毒表达系统表达嵌合蛋白，分别命名为VP60-2F、VP60-306F和VP60-578F。通过电镜观察嵌合蛋白自聚为病毒样颗粒的能力，动物免疫试验结果显示，将病毒样颗粒免疫小鼠后均可产生针对VP60和B细胞表位特异的免疫应答。

2.3 猪细小病毒病

猪细小病毒病是由猪细小病毒(PPV)引起的母猪繁殖障碍性疾病，主要临床表现为流产、产死胎、产畸形胎、胎儿木乃伊化和不孕等，初产母猪受到的危害最为严重[14]。VP2是PPV的主要衣壳蛋白，具有良好的免疫原性，当用体外表达系统表达时能自我装配形成VLPs。另外，VP2蛋白可以作为一种抗原的转运载体，携带外源表位，组装成嵌合表位VLPs，嵌合表位VLPs免疫动物具有双重的免疫效果。Antonis等[15]用杆状病毒产生猪细小病毒样粒子，用低于1μg的该VLPs以油包水的形式分别免疫豚鼠和猪，均产生了很高的血清抗体滴度，仅用0.7 fg猪细小病毒样粒子免疫母猪，一次免疫就可以保护胎儿不受致死剂量的PPV的攻击。陈杨[16]扩增了PPV SC1株VP2基因，将其插入真核表达载体pPI-2.EG-FP中，构建转移载体pPI-2.EGFP.VP2。采用脂质体介导法将猪伪狂犬病病毒(PRV)SA215株DNA与pPI-2.EGFP.VP2DNA共转染Vero细胞获得重组病毒PRV SA215/VP2株。以兔抗VP2的多克隆抗体建立的免疫荧光技术可检测到Vero细胞发出的特异性荧光，表明PPV VP2成功插入到PRV SA215基因组中，并获得表达。进一步电镜观察表明，感染PRV SA215/VP2的Vero细胞中可同时观察到PRV与PPV两种VLPs。徐志文等[17]构建了含PCV2 ORF2基因和PPV VP2基因的重组质粒pEGFPVP2.ORF2，由脂质体介导转染Vero细胞，对转染细胞进行电镜检测，结果观察到VLPs存在。将纯化后的VLPs免疫仔猪，检测其血中T淋巴细胞的动态变化以及血清抗体水平。结果免疫仔猪的CD3、CD4 T淋巴细胞在外周血淋巴细胞中的比率均有一定程度的升高，CD8 T淋巴细胞在免疫后7～14 d有所下降，之后再升高。抗体检测结果表明，免疫动物血清中有较高水平的PPV、PCV2特异性抗体。

2.4 猪乙型脑炎

日本脑炎(JE)是由乙型脑炎病毒(JEV)引起的感染性疾病，JEV可引起母猪繁殖障碍，给养猪业带来巨大损失。JEV基因组为单股正链RNA，全长约11kb，含有三个结构蛋白，衣壳蛋白(C)，膜前体蛋白(prM)和包膜糖蛋白(E)。其中prM蛋白成熟后被剪切成M蛋白，与病毒感染能力相关，是病毒诱发保护性免疫的重要协同成分，可产生微弱的中和抗体。E蛋白为糖蛋白，是诱导产生中和性抗体的主要抗原成份，可介导膜融合，引起血凝反应。张艳芳等[18]将乙型脑炎病毒prME及其信号肽基因片段克隆到穿梭载体AcBacmid中，构建重组穿梭载体AcBac-prME。其转染Sf9细胞，获得重组杆状病毒Ac-prME。Western-blotting、间接免疫荧光试验及电镜观察，证实Ac-prME介导prME在Sf9细胞中高效表达，且形成了病毒样颗粒。小鼠免疫和攻毒试验表明，该病毒样颗粒免疫可以使小鼠获得有效抵抗乙型脑炎病毒强毒株攻击的能力，保护率高达100%。

2.5 猪繁殖与呼吸综合征

猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的母猪繁殖障碍性疾病，临床表现主要为流产、产死胎、弱胎、木乃伊胎，妊娠母猪的后期流产，流产率可达30%以上，小猪的死亡率在35%～40%。PRRSV可经口腔、鼻腔、肌肉及生殖道等多种途径感染猪发病。王璐等[19]为构建高致病性PRRSV(HP-PRRSV)VLPs疫 苗， 以HP-PRRSV CQ株的GP5和M蛋白的全部编码基因为模板，利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统能够成功地共表达重组质粒pFastBac1-GP5-M的GP5蛋白和M蛋白，并能自动装配成VLPs，电镜观察到VLPs的直径约为50 nm，该VLPs与天然蛋白类似的免疫原性。吕凤林等[20]公开了一种PRRSV VLPs的研究方法。该疫苗是由PRRSV GP5、M、N3种蛋白构成的VLPs，动物试验结果表明，形成的VLPs加入或不加入佐剂制备的注射剂型、滴鼻剂型、饮水剂型，免疫不同时期的猪群都能够安全有效地预防PRRSV感染。Nam等[21]利用杆状病毒表达载体，在Sf9昆虫细胞中同时表达GP5和M蛋白，成功制备出PRRSV VLPs，用蔗糖梯度离心方法对其进行纯化，并用不同量(0.5μg、1.0μ g、2.0μ g、4.0μ g)纯化后的蛋白混合弗氏佐剂免疫小鼠，检测血清抗体效价和细胞因子IL-4、IL-10、IFN-γ水平，结果显示，该疫苗可以有效引起机体的细胞免疫和体液免疫，其中GP5抗体效价显著高于阴性对照，免疫4.0μ g剂量的IFN-γ水平显著高于阳性对照，但阳性对照的IL-4、IL-10细胞因子水平高于试验组，同时仅在免疫2.0μ g和4.0μ g VLPs的小鼠体内检测到中和抗体水平。

2.6 猪瘟

猪瘟是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种猪急性、热性、高度接触性传染病，在世界范围内广泛流行，其发病率和死亡率均高，对养猪业危害十分严重。范京惠等[22]构建了含CSFV的优势T细胞表位E290和PPV VP2基因的重组PM-VP2-E290，与Bac-N-BlueDNA共转染昆虫细胞sf9，获得重组杆状病毒将传3代的重组杆状病毒接种于形成50%单层的sf9细胞，应用免疫电镜对表达产物进行观察，可见到许多VLPs，表明目的基因在杆状病毒表达系统中得到了表达，且表达的蛋白能自我装配成VLPs，大量表达VLPs后，在无佐剂参与的情况下，按确定的免疫程序免疫6～8周龄的BALB/c小鼠，检测小鼠的细胞免疫和体液免疫学指标。结果表明，该VLPs不仅能诱导小鼠机体产生抗CSFV的特异性CTL反应，还能刺激小鼠产生抗PPV的特异性中和抗体。

2.7 猪传染性胃肠炎

猪传染性胃肠炎(TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)引起的一种以呕吐、水样腹泻、脱水为主要特征高度传染性疾病，各种不同品种和日龄的猪都能感染，2周龄受到的危害最为严重，死亡率可高达100%。冷勇等[23]构建了含TGEV M和sM结构蛋白基因的重组杆状病毒rBac-M和rBac-M-sM，将重组杆状病毒rBac-M和rBac-M-sM分别感染sf9昆虫细胞，进行VLPs的体外组装试验。结果表明，M蛋白在sf9细胞内单独表达，M蛋白和sM在sf9细胞内共同表达，都可形成TGEV VLPs，而且病毒粒子大小不等，直径在61～101 nm。

2.8 猪流感

猪流感(SI)是由猪流感病毒(SIV)引起的一种急性、热性、高度接触性呼吸道传染病。各种日龄和品种的猪均易感，临床上主要表现为发病急、呼吸困难、咳嗽、流泪、鼻液增多、衰竭、低死亡率等[24]。在我国猪群中流行的血清型主要是H1N1、H1N2和H3N2。Quan等[25]用杆状病毒表达系统表达了H1N1流感病毒血凝素和基质蛋自，共同感染昆虫细胞后形成VLPs。用该VLPs肌注免疫小鼠，仅免疫一次，即可诱导小鼠产生以IgG2a为主的抗体反应，并且产生很高的血凝抑制滴度和记忆性IgG和IgA反应，更重要的是低剂量的VLPs就可产生抵抗致死剂量病毒感染的保护作用。

3 小结与展望

VLPs作为一种新型亚单位疫苗，具有多种优点，不含有病毒核酸，不具有感染性，能模拟天然的病毒粒子，易被免疫系统识别，不需要佐剂，低剂量免疫后就能刺激机体产生良好的免疫应答发应，因此，在某此程度上，有替代传统的疫苗的潜力，在动物疾病的防治方面有广阔的应用前景。但在VLPs的研制过程中也存在一些问题，首先，VLPs疫苗的设计、表达、组装及纯化等对技术条件要求比较高，而且不是所有病毒都能组装成VLPs。其次，当组装多种蛋白形成的病毒样粒子时，各个基因表达量的比例难以控制，表达不同蛋白的载体进入同一细胞的几率小，产生VLPs的几率相对降低，建立多基因共表达载体的难度大。另外，某些蛋白可能对细胞具有毒性，使其表达量较低，甚至引起其他蛋白的表达量降低，从而导致VLPs装配效率的下降。再次，如何有效放大工艺水平，提高VLPs的组装效率，降低成本等方面也存在着诸多挑战。最后，VLPs采用不同的免疫途径，其免疫效果不同，需要对不同的VLPs的免疫途径进行研究，找出最佳的免疫途径。发展多样的VLPs疫苗将是一个趋势。VLPs作为一项新兴的技术，在新型猪病疫苗的研制中代表了一种非常有前途的研究方向，相信通过各国专家学者的共同努力，不久的将来VLPs疫苗必将为猪病毒病的防控提供新的技术手段。

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