病毒样颗粒的常用表达系统和应用进展

郭慧敏，缪秋红，谭永贵，朱 杰，刘 腾，刘光清

（中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

病毒样颗粒的常用表达系统和应用进展

郭慧敏，缪秋红，谭永贵，朱 杰，刘 腾，刘光清

（中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

病毒样颗粒是由病毒的结构蛋白组成，不含感染所必需的核酸成分，没有感染性和复制能力，但是可以同时引起细胞免疫和体液免疫。由于具有与亲本病毒相似的形态和结构的特点，病毒样颗粒受到研究者的极大关注。与其他病毒亚单位疫苗相比，病毒样颗粒具有安全高效的特点。本综述论述了病毒样颗粒的常用表达系统以及在生物制品方面的应用。

病毒样颗粒；表达系统；生物制品

Abstract:Virus-like particles (VLPs) formed by the structural proteins of viruses are essentially devoid of infectious genetic materials.Therefore, VLPS are non-infective and non-replicable but can still stimulate strong humoral and cellular immune responses. In the recent years, VLPs have received considerable attention due to their structures and morphology similar to native viruses. VLPs are safer and more effective than many other kinds of subunit vaccines against animal viral diseases. This paper reviews the expression systems and applications of VLPs in biological products.

Key words:Virus-like particles; expression systems; biological products

疫苗接种仍然是当前控制和预防疾病感染的最有效途径。目前最主要的疫苗以灭活或弱毒疫苗为主[1]，但这些疫苗具有很高的效力的同时也伴随一些副作用，比如疫苗生产过程中存在传播病原体的风险、化学灭活不彻底及弱毒毒力返强等问题。随着现代分子生物技术的兴起，特别是重组DNA技术和基因工程的不断发展，亚单位疫苗越来越受到研究者的关注[2,3]。亚单位疫苗是将病原体的保护性抗原基因在表达系统中表达，并以蛋白质或多肽的形式制备成疫苗。该类疫苗具有安全性好，纯度高，稳定和生产方便等特点，但相比传统疫苗，其免疫效果较差，这就要求在实际使用中，需要增加剂量，或通过使用免疫增强剂或佐剂的方式提高免疫效力，从而使亚单位疫苗的实际应用受到了极大限制。病毒样颗粒（virus-like particles，VLPs）是亚单位疫苗研究中发现的一种具有高免疫效力、高安全性的疫苗，具有很高的研究价值和应用前景。

VLPs是利用重组DNA技术，由单个或多个结构蛋白形成的空心病毒衣壳。VLPs没有核酸成分，不能自我复制，没有感染性。这些特点使得其在疫苗生产，疫苗投递系统及生物工具方面都具有巨大的优势。本综述将从常用表达系统及其应用前景等方面介绍VLPs。

1 常用表达系统

现今绝大多数已批准的亚单位疫苗都是基于VLPs设计的。细菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞等表达系统都已广泛应用于VLPs的生产。

1.1 大肠杆菌作为当前制备重组蛋白的最广泛的表达系统，大肠杆菌表达系统并没有广泛用于VLPs的制备，这主要是由于其缺少类似哺乳动物细胞的翻译后修饰系统。但研究发现大肠杆菌中可以表达一些无囊膜VLPs，这些无囊膜VLPs是由病原体的某个成分在大肠杆菌中表达并自我组装形成，这些成分往往是病毒的结构蛋白，具有自我组装形成VLPs的特性[4]。全球第一个利用大肠杆菌表达的VLPs是戊型肝炎疫苗，该疫苗是通过将戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus，HEV）的E2蛋白N端延伸至氨基酸368位置，并在大肠杆菌中表达重组蛋白p239，然后与铝佐剂混合配置成疫苗。动物保护实验结果显示，即使在高滴度HEV的存在下仍可预防肝炎的发生，表明该疫苗具有良好的免疫原性和免疫保护力[3]。近几年来，利用大肠杆菌表达系统制备VLPs的技术取得了一系列突破。有研究通过引入分子伴侣蛋白SUMO以及低温培养的策略，促进病毒结构蛋白在大肠杆菌中可溶性表达，并成功制备了2型猪圆环病毒样颗粒[5]和犬细小病毒样颗粒[6]。

1.2 酵母酵母是另一种重要的重组蛋白表达系统，也被广泛应用于VLPs的生产。默克公司生产的可用于防治早期宫颈癌，阴道癌的Gardasil®和用于治疗乙型肝炎的Recombivax HB®都是通过该表达系统生产的[7]。其中Gardasil®包含16、18、6和11型人乳头状瘤病毒（papilloma virus，HPV）的病毒样颗粒并与铝佐剂混合。尽管如此，与大肠杆菌相似，酵母在翻译后修饰功能特别是蛋白糖基化的不足，限制了其在生产VLPs上的应用。该系统通常也用于生产无囊膜VLPs，但含有艾滋病毒（Human immunodeficiency virus，HIV）的囊膜蛋白成分的Pr55Gag的VLPs在HIV-1在酵母中也获得了成功的表达参考文献。

1.3 昆虫细胞昆虫表达系统中最常用的是昆虫-杆状病毒表达系统，当前葛兰素史克公司生产的包含16和18型HPV的VLPs的疫苗就是通过该系统生产的，并由氢氧化铝及3-脱酰基单磷酰脂质A组成佐剂。昆虫细胞表达系统可以行使蛋白的翻译后修饰功能[8]，对目的蛋白进行糖基化，并且可以使得外源蛋白大量积累，同时不含动物病原体。但由于目的蛋白与杆状病毒颗粒共表达，容易被污染，因此，VLPs的纯化是使用昆虫-杆状病毒表达系统时经常面临的问题。昆虫-杆状病毒表达系统不仅可以用于生产无囊膜VLPs也可以生产具有囊膜结构的VLPs。已有研究利用Sf21细胞成功表达了小反刍兽疫病毒样颗粒[8]，而兔出血症病毒样颗粒也已在Sf9细胞中成功表达[9]。另外艾滋病病毒、人乳头状瘤病毒、轮状病毒等都可以通过昆虫-杆状病毒表达系统生产VLPs。昆虫细胞种类中的S2细胞是半悬浮生长细胞，这类细胞可以独立于病毒感染来表达功能蛋白。S2细胞可以悬浮生长并且容易达到高浓度，不但可以用于连续培养，而且容易扩大生产规模，已经成为研究者最新关注的表达系统。

1.4 哺乳动物细胞相比其他翻译系统，哺乳动物细胞表达系统最大的特点是能正确有效地识别真核蛋白的合成、加工和分泌信号，特别是能精确地完成糖基化、磷酸化等翻译后修饰的过程，产生的蛋白具有完整的结构和功能，因此被大量用于治疗性重组蛋白的生产和研究。目前针对新生儿的用于预防乙肝病毒的GenHevac B®[10]和Bio-Hep®（Sci-B-VacTM）和针对大于18周岁的成人的Hepacare®都是通过在中国仓鼠卵巢细胞中表达的[11]。但哺乳动物细胞表达系统存在表达量低，生产成本较高，细胞株稳定性不足以及潜在的安全问题等，是实际生产中面临最大的问题[12]。随着外源蛋白翻译后修饰问题的日益突出，如何提高该表达系统的表达水平，改进生产工艺成为当下研究者所关注的重点。

2 应用进展

2.1 病毒样颗粒作为病毒与宿主免疫研究的一种模型VLPs具有与亲本病毒在形态大小和结构上相似的特点，一方面，可以在低生物安全水平条件下，用于研究高致病性病毒的侵入及病毒粒子的抗体中和反应[13]，而且VLPs作为载体可以携带外源病毒基因，同时可以研究病毒基因的复制和原始转录；另一方面，VLPs可以用于研究抗原递呈细胞（antiqenpresenting cell，APC）特别是树突状细胞如何对病原体进行识别，递呈[14]以及加工等过程以及在受到特异性刺激后诱导特异性免疫应答的过程[15]。

2.2 病毒样颗粒作为疫苗病毒样颗粒是病毒结构蛋白自我组装形成的模拟自然病毒衣壳结构的蛋白复合体。一直以来（辅助性T）Th1细胞应答被认为是研制疫苗中的一个限制因素。对于大部分病原体，接种疫苗产生的保护性来源于特异性的中和抗体。由于VLPs可多重地，高密度地呈现抗原表位，因此相比其他亚单位疫苗，由VLPs组成的疫苗可诱导细胞毒性T细胞和辅助性T细胞的产生,高效地诱导体液免疫和细胞免疫[16]。这表明，相比其他亚单位疫苗，低剂量的VLPs疫苗即可以引起相似的保护性免疫应答。不过也有研究发现，大部分的VLPs只有在佐剂的存在下才能引起细胞免疫，而且，即使是形状大小相似的VLPs，如乳头瘤病毒和多瘤病毒，引起的免疫应答情况也不同[17]。另外选择不同的佐剂、不同给药途径也会引起不同的免疫应答。为了得到好的免疫保护效力，有些病毒的VLPs，比如甲型流感病毒，可以形成与天然病毒粒子近似的病毒样颗粒结构，达到很好的免疫效果[18]。而另外一些病毒则需要对VLPs进行修饰，比如乙肝HBV疫苗就是将大囊膜和中囊膜蛋白包含于乙肝病毒颗粒中，这样不仅增加了动物的中和抗体范围，更重要的是增加了额外的T细胞表位，促进早期的抗乙肝病毒反应[19]；而对于艾滋病病毒，为了使得VLPs模拟完整的艾滋病病毒粒子，设计将与gag核心蛋白相关的囊膜蛋白包含于VLPs中[20]。疫苗制备的一个重要需求是安全性，VLPs作为空壳蛋白结构，不含病毒核苷酸，没有感染性，避免了弱毒疫苗和灭活疫苗的潜在的病毒复制、返强的安全隐患，具有极大的安全优势。

2.3 病毒样颗粒作为抗原投递工具疫苗能否激活机体的免疫系统，与给药途径和佐剂的正确选择是分不开的[21]。抗原被抗原递呈细胞（APCs）递呈给免疫细胞，而APCs通常可以识别直径20 nm～3μm大小的抗原，树突状细胞识别抗原的最适直径为40 nm[15]，恰恰与VLPs的大小范围相一致。这表明，一方面，VLPs可以作为疫苗携带VLPs亲本病原体的抗原，另一方面可以作为抗原投递载体携带其他病原体的抗原，通过抗原递呈细胞捕获，并交叉递呈活化免疫细胞，激活免疫系统。一种方法是在体外将VLPs和目的抗原分别合成，通过化学结合的方法（比如共价键结合）将目的抗原连接到VLPs的表面附着点上[22]。这样抗原的大小和结构就不会受到VLPs折叠时的影响，可以保持完整的抗原性结构和功能。另外一种方法是将目的基因与病毒的结构基因融合形成嵌合VLPs。VLPs不仅可以携带亲本病原体的抗原作为预防性疫苗，而且可以作为载体携带线性抗原，环形抗原，非蛋白成分等[23]应用于疫苗中去。

2.4 VLPs作为疾病的监控和诊断工具传统疫苗接种时，很难区分受感染动物是来自于病原体还是来自于疫苗本身。为此研究者研制了可以区分两者的 DIVA（differentiating infected from vaccinated animals）疫苗[24]。作为一种标记疫苗，这种疫苗通常是来自于缺失了一种或多种免疫原蛋白的疫苗株。VLPs是由一种或多种结构蛋白组成，不含病毒基因组，是一类更加安全的疫苗。另外，VLPs疫苗设计时可以根据病毒血清型的要求设计包含单价抗原或多价抗原的VLPs疫苗，这样DIVA疫苗接种时使用DIVA型的VLPs疫苗，不仅可以预防控制疾病，还可以监测和诊断疾病的发生和在动物群中流行情况。

3 现有问题及应用前景

基于VLPs设计的疫苗被认为既可以引起抵抗多种抗原的强烈的体液免疫和细胞免疫，同时相比传统疫苗更是一种安全的疫苗，并且由于其与亲本病毒的大小和形态相似的特点，衍生出其在疫苗工艺中扮演佐剂和载体的功能，这都引起了研究者的极大兴趣。但是，VLPs的应用同样具有很多限制性因素。首先，VLPs的制备工艺问题。如何在实际应用中选择最合适的表达系统是面临的首要问题，特别是当VLPs投入商业生产时，需要综合考虑其安全性、效率性、生产成本还有免疫方式等问题。其次，尽管研究表明相比其他亚单位疫苗，VLPs具有安全、高效的特点，现有的VLPs疫苗会引起特异性的B细胞免疫和T细胞免疫，但在病毒感染机体期间，有些病毒的抗原表位会发生变异，而VLPs对于变异后的抗原表位并不能引起机体高效的免疫应答；佐剂使用和免疫方式也会影响VLPs的免疫效果。再次，从实际考虑，商业预防疫苗更多是多价疫苗，而VLPs的空间是有限的，如何将不同特异性蛋白结合于VLPs表面而不影响VLPs的正确折叠也是问题之一。VLPs尽管仍面临众多在生产工艺和使用方法方面的问题，但其在疫苗生产、疫苗制备工艺以及DIVA疫苗方面所展现的优势仍为新型疫苗的研制提供了重要的研究平台和广阔的应用前景。

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EXPRESSION SYSTEMS OF VIRUS-LIKE PARTICLES AND PROGRESS ON THEIR APPLICATIONS

GUO Hui-min, MIAO Qiu-hong, TAN Yong-gui, ZHU Jie, LIU Teng, LIU Guang-qing

(Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

S852.43

A

1674-6422（2017）04-0082-05

2016-01-18

公益性农业科研专项（201303046）；上海市科委创新项目（13391901602）

郭慧敏，男，硕士研究生，预防兽医学专业

刘光清，E-mail：liugq@shvri.ac.cn.