继发型肺结核患者下呼吸道内赛多孢子菌定植初探

曾敬思 李宏杰 毛叶红 连昕 郑岳臣

(1.华中科技大学同济医学院附属协和医院皮肤性病科,武汉 430022；2.武汉市医疗救治中心感染科，武汉 430023)

·论著·

继发型肺结核患者下呼吸道内赛多孢子菌定植初探

曾敬思1李宏杰2毛叶红1连昕1郑岳臣1

(1.华中科技大学同济医学院附属协和医院皮肤性病科,武汉 430022；2.武汉市医疗救治中心感染科，武汉 430023)

目的 初步了解赛多孢子菌 (Scedosporium)在继发型肺结核患者下呼吸道内感染或定植状况。方法 收集101例继发型肺结核患者的支气管肺泡灌洗液，分别使用真菌镜检、选择培养基培养及扩增部分β-微管蛋白基因的聚合酶链式反应-反转线状点杂交 (PCR-RLB)方法，检测常见的5种赛多孢子菌病的致病菌，即S.apiospermum、S.boydii、S.minutispora、S.aurantiacum及S.dehoogii。结果 101份受检标本均未检测到上述5种赛多孢子菌。结论 在继发型肺结核患者中未见常见5种赛多孢子菌呼吸道感染或定植，提示继发型肺结核患者并发赛多孢子菌病的可能性不大。

肺结核;赛多孢子菌;下呼吸道;定植

赛多孢子菌属 (Scedsporium)为一类腐生真菌，广泛分布于世界各地，存在于土壤、富含腐败物的淤泥、污水排放沟渠、污染水体等处。在人类活动导致污染严重的环境中分布的密度更高。目前基于分子系统发生学确立的种有6个[1]。引起人类感染赛多孢子菌病 (Scedosporiosis)的主要为尖端赛多孢子菌 (Scedosporiumapiospermum)和Scedosporiumboydii。临床上还偶见S.minutispora、S.aurantiacum和S.dehoogii感染。

赛多孢子菌为条件致病菌，主要经呼吸道吸入和经皮肤黏膜外伤侵入人体。在健康人群多表现为局部感染，免疫异常患者则可发生播散性感染。常见受累器官为皮肤、眼、肺和脑。由于赛多孢子菌对目前常用抗真菌剂大多耐药，所以播散感染或重要脏器受累时，预后不良，常危及生命。

结核病是严重危害人类健康的慢性传染病，其主要经呼吸道传播，肺结核的主要类型为继发型肺结核。我国近年来每年报告的肺结核患者数约100万，位居甲乙类传染病的前列[2]，有高患病率、高感染率、高耐药率、青壮年结核和死亡比例高等流行病学特点[3]。结核患者多见于细胞免疫功能低下患者，Scedosporium是否在这些特定人群中定植，成为潜在威胁值得关注。

为此，我们选取继发型肺结核患者为研究对象，对赛多孢子菌在呼吸道中的定植及感染状况进行初步研究。

1 材料与方法

1.1 材料

2014年12月～2015年3月期间，收集临床和 (或)实验室诊断继发型肺结核及合并支气管结核的住院患者的支气管肺泡灌洗液。共收集到101例患者标本，其中男61例，女40例。患者多有程度不等咳嗽、咳痰、午后低热、夜间盗汗、咯血、胸痛、胸闷、活动后气促等症状。其中，痰结核菌涂片阳性病例8例；其余痰结核菌涂片阴性，病例诊断均符合我国2001年版《肺结核诊断和治疗指南》[4]中肺结核诊断标准。病例均为初治患者。其中处于2个月强化期内的病例68例 (治疗方案为HRZE)；巩固期内的病例33例 (治疗方案为HRE或HRZ)，总疗程6～15个月。伴发基础疾病的有：糖尿病3例，胸腺瘤合并重症肌无力1例，血吸虫病1例。标本来自左侧肺部33例，右侧57例，双侧3例，不详8例。

赛多孢子菌选择培养基 (SceSel+培养基)根据Rainer等[5]的方法配制，4℃保存待用，保存时间不超过2周。痰消化液为Sputasol (Thermo Fisher Oxoid,Basingstoke,England)。真菌DNA提取试剂盒为Biopsin Fungus Genomic DNA Extraction Kit (Bioer Technology Co.,Ltd,P.R.China)。聚合酶链式反应 (PCR)所用dNTP及GoTaq flexi Master mix为Promega,U.S.A产品。用于扩增赛多孢子菌编码β-微管蛋白基因的部分片段的通用引物及检测S.apiospermum、S.boydii、S.minutispora、S.aurantiacum以及S.dehoogii的特异性探针参见Lu等的文献[5]，由生工生物工程 (上海)股份有限公司合成。反转线状点杂交 (RLB)所用加样板为miniblotter MN45 (Immunetics,Manifold,Australia)。过氧化物酶标记的链霉亲和素偶联物 (peroxidase labeled streptavidin conjugate)为EMD Biosciences,Inc.La Jolla,U.S.A.产品，过氧化物酶化学发光结合底物 (HRP Chemiluminescence Blotting Substrate)来自Millipore Corporation,Billerica,USA。X线感光胶片为富士公司产品。

1.2 方法

每一病例留取5 mL支气管肺泡灌洗液，经痰消化液消化后洗涤、离心，取沉渣 (参考厂家建议方法)。沉渣分为3份，1份直接10%KOH涂片镜检，判断有无真菌菌丝及孢子；1份50 μL接种到赛多孢子菌选择培养基 (SceSel+培养基)，30℃培养2～4周，并同时接种参考株S.boydiiCBS101.22于一平皿中作为阳性对照，挑取疑似菌落镜检并转种培养，形态学初步鉴定是否为赛多孢子菌；剩余1份用于提取真菌DNA (依据厂家建议方案)，并参照Lu等[6]的方法行聚合酶链式反应 (PCR)-反转线状点杂交 (RLB)，检测S.apiospermum、S.boydii、S.minutispora、S.aurantiacum以及S.dehoogii的编码β-微管蛋白基因的部分DNA片段。每次检测试验均设立阳性及阴性对照。

2 结 果

101份标本中，真菌直接镜检均未见菌丝及孢子。除8例未接种培养外，其余均未培养分离出赛多孢子菌，对照接种的参考株生长良好。培养出非赛多孢子菌菌落有27例 (2种菌落混合存在2例)：大量酵母样菌落 (>5个/平皿)2例；少量酵母样菌落 (<5个/平皿)5例；大量暗色霉菌菌落 (>5个/平皿)1例；少量霉菌菌落 (<5个/平皿)20例，其中暗色霉菌1例；细菌菌落1例。101例标本均予以了PCR-RLB检测，也未检测到赛多孢子菌β-微管蛋白基因的部分DNA片段。

3 讨 论

近几十年来赛多孢子菌病病谱发生着变迁。在欧美国家20世纪五六十年代，患者多无基础疾病，感染主要为足菌肿。70年代后，危险致病因素主要为使用糖皮质激素、实体器官移植、恶性血液病、肺囊性纤维化病及溺水，而90年代后实体器官移植后出现的感染增长最快。肺、中枢神经系统、眼、鼻窦感染逐步增多，其中最常见的为肺赛多孢子菌病[7]。在一项对实体器官移植受体的赛多孢子菌定植或感染的调查研究中发现，59%的受体有肺赛多孢子菌定植，且均为肺移植受体；其余41%的受体为赛多孢子菌感染，其中肺移植受体占55%[8]。另外，在肺囊性纤维化病患者呼吸道内赛多孢子菌的定植比例也较正常人群高。赛多孢子菌在呼吸道中定植情况增加，与赛多孢子菌病在这些特定人群中发病率高度相关[9-10]。

1977～2015年间中国报道的赛多孢子菌病有24例，最多受累的为呼吸系统 (7例)，其次为中枢神经系统 (6例)。已知诱发因素的有15例，分别为外伤 (7例)、手术并使用抗生素 (4例)、溺水 (3例)及骨髓移植 (1例)。从中可以初步看出这些诱因不同于欧美国家。除了我国对赛多孢子菌病认识不足或关注较晚，病例报道较少，不排除我国本病的易感人群不同于西方国家的可能。

肺结核在欧美国家少见，而在我国是主要的呼吸道感染性疾病之一。其治疗一直以来都是一个难题，肺结核病严重影响着人们的健康和生活质量。赛多孢子菌是否在这些特定人群中定植，成为潜在威胁值得关注。

本研究显示，在肺结核患者呼吸道内未发现常见的5种赛多孢子菌的定植或感染。这一结果初步提示，在我国肺结核患者中赛多孢子菌呼吸道定植或感染的可能性不大。目前尚未见肺结核合并赛多孢子菌感染的报道，此状况与本研究结果相符。

本研究中，尽管使用的是赛多孢子菌的选择培养基，但仍有2例标本培养出大量酵母样菌落，1例培养出大量暗色毛样菌落。虽然没有将所得菌落做进一步的菌种鉴定，灌洗液沉渣直接镜检也未见菌丝及孢子，但不排除这些患者可能合并有真菌感染，或存在真菌定植，为患者二重感染的潜在威胁。国内有研究表明肺结核患者合并真菌感染达4.77%[11]，在老年患者中高达21.88%[12]，最常见的为白念珠菌[11-12]。肺结核患者呼吸道内真菌感染与患者死亡比例高是否有关，值得进一步观察研究。

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[2] 刘英姿.艾滋病患者中结核病的患病情况及发病趋势分析[J].中国医药指南,2013，11(24):261-262.

[3] 何瑞玲.结核病耐药性的流行病学调查分析[J].中国医药指南,2013,11 (1):524-525.

[4] 中华医学会结核病学分会.肺结核诊断和治疗指南[J].中华结核和呼吸杂志,2001,24(2):70-74.

[5] Rainer J,Kaltseis J,de Hoog SG,et al.Efficacy of a selective isolation procedure for members of thePseudallescheriaboydiicomplex[J].Antonie Van Leeuwenhoek,2008,93(3):315-22.

[6] Lu Q,Gerrits van den Ende AH,Bakkers JM,et al.Identification ofPseudallescheriaandScedosporiumspecies by three molecular methods[J].J Clin Microbiol,2011,49(3):960-967.

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[11] 李秀萍,王玉清,程国栋,等.肺结核患者真菌感染的临床特点及耐药性分析[J].中华医院感染学杂志,2016,26(14):3141-3143.

[12] 孙家斌.老年肺结核合并肺部真菌感染的临床及药敏研究[J].医疗装备,2016,29(2):83-84.

[本文编辑] 卫凤莲

Colonization or infection ofScedosporiumin lower respiratory tract of secondary pulmonary tuberculosis patients

ZENG Jing-si1,LI Hong-jie2,MAO Ye-hong1,LIAN Xin1,ZHENG Yue-chen1

(1.DepartmentofDermatologyandVenereology,UnionHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongScienceandTechnologyUniversity,Wuhan430022,China;2.DepartmentofInfectiousDisease,WuhanMedicalTreatmentCenter,Wuhan430023,China)

Objective Understanding colonization or infection ofScedosporiumin lower respiratory tract of secondary pulmonary tuberculosis.Methods Major pathogens of Scedosporiosis,5Scedosporiumspp.(S.apiospermum,S.boydii,S.minutispora,S.aurantiacumandS.dehoogii),were detected in bronchoalveolar lavage fluid from the patients with secondary pulmonary tuberculosis using direct microscope examination,fungal culturing and PCR-based reverse line blot (PCR-RLB) targeting the partial β-tubulin gene.Result NoScedosporiumspp.were found in 101 specimens of bronchoalveolar lavage fluid from secondary pulmonary tuberculosis patients.Conclusion RareScedosporiumspp.colonize or infect in lower respiratory tract of secondary pulmonary tuberculosis.It implies that secondary pulmonary tuberculosis complicated by Scedosporiosis due to increasing colonization ofScedosporiumspp.in the respiratory tract will be uncommon.

pulmonary tuberculosis;Scedosporium;lower respiratory tract;colonization

89-91]

湖北省自然科学基金 (2008CDZ014)

曾敬思，女 (汉族)，博士，副教授，副主任医师，硕士研究生导师.E-mail:wuhanzjs@aliyun.com；李宏杰,男 (汉族)，本科，副主任医师.E-mail:2465059569@qq.com

R 519.8

A

1673-3827(2017)12-0089-03

2016-12-07