肾阳虚型抑郁症大鼠模型的建立和评价

何书芬，居文政，胡浩彬，朱立静，戴国梁，张 倩

(1. 南京中医药大学附属医院，江苏 南京 210029；2.江苏省食品药品监督检验研究院中药室，江苏 南京 210008 )

◇实验方法学◇

肾阳虚型抑郁症大鼠模型的建立和评价

何书芬1，居文政1，胡浩彬2，朱立静1，戴国梁1，张 倩1

(1. 南京中医药大学附属医院，江苏 南京 210029；2.江苏省食品药品监督检验研究院中药室，江苏 南京 210008 )

目的 建立肾阳虚抑郁症大鼠病证结合动物模型并进行评价。方法 将24只大鼠按体质量区间分组法分为对照组、模型组、自愈组；模型组与自愈组连续21 d注射氢化可的松，对照组给予等体积生理盐水。造模结束后，各组进行相关指标检测：旷敞试验、糖水偏好试验、强迫游泳试验，LC-MS/MS法测血浆中5-HT、DA、NE的含量；取肝、肾、脾、胸腺、肾上腺、睾丸及附睾，计算脏器指数。结果 与对照组相比，模型组大鼠出现毛发干枯、畏寒、拱背蜷缩等症状，体质量增长明显迟缓，强迫游泳的不动时间明显延长，糖水偏好降低，旷敞试验水平得分、垂直得分均降低，肝、肾、脾、胸腺、睾丸及附睾的脏器指数不同程度降低，血中5-HT、NE含量增加；与模型组相比，自愈组大鼠血浆5-HT、NE、DA明显下降，且5-HT、DA明显低于对照组。结论 连续注射氢化可的松诱导肾阳虚型抑郁症大鼠模型是一种可行的方法。

抑郁症；肾阳虚；氢化可的松；动物模型；指标检测；LC-MS/MS

抑郁症是一种以持续情绪低落为主要症状的精神情志障碍性疾病，具有患病率高、自杀率高、难治愈及复发率高的特点，是全球性公共卫生问题之一。中医认为抑郁症病因病机复杂，近年来中医医家认为肾阳主导抑郁症发生，肾阳不足是抑郁症的基础病机，临床及动物实验表明辅以温补肾阳法治疗抑郁症取得更好的效果。研究表明糖皮质激素及其受体与抑郁症密切相关[1]，且目前肾阳虚抑郁症动物造模方法主要是给予外源性糖皮质激素，本实验试图通过注射氢化可的松建立肾阳虚型抑郁症大鼠模型，从行为学及生理变化多方面评价模型，为进一步开展肾阳虚型抑郁症的病理病机研究及筛选合适的中药治疗肾阳虚型抑郁症奠定基础。

1 材料与方法

1.1 药物及试剂 注射用氢化可的松琥珀酸钠粉针剂(天津生物化学制药有限公司，产品批号：021509017，规格10 mg/片)，用生理盐水配成浓度为4 mg·mL-1，对照品盐酸五羟色胺、盐酸多巴胺均购于Sigma公司(批号分别为1001528057、101280875)；重酒石酸去甲肾上腺素、内标替硝唑均购于中国药品生物制品检定所(批号分别为：100169-201103、100336-200402)，苯甲酰氯购于成都科龙化工试剂厂(批号：20120529，分析纯，98%)，甲醇、乙腈为色谱纯，甲酸、乙酸铵、四硼酸钠等均为分析纯，实验用水为超纯水。

1.2 仪器 Waters Quattro Micro液质联用仪(美国Waters公司)，色谱工作站：Masslynx4.1；梅特勒-托利多AE240电子天平(上海梅特勒-托利多有限公司)；Thermo Micro17冷冻高速离心机(美国Thermo公司)；Millipore Driet-Q5超纯水机(法国Millipore公司)；WH-2微型旋涡混合仪(上海沪西分析仪器厂)，游泳缸，自制敞箱，-20 ℃冰箱(海尔)，非接触性红外测试温度计(Vicks)。

1.3 动物及造模方法 SPF级健康成年SD大鼠24只，♂，体质量(150±20) g，由南通大学提供，合格证号：(苏)2014-0001SPF级，实验前适应性饲养1周，保持12 h昼夜节律，室温(22±2) ℃，湿度50%，自由摄食饮水。按体质量区间分组法将大鼠随机分为空白组、模型组、自愈组，8只/组，4只/笼。模型组、自愈组大鼠每天14:00左右臀部肌肉注射氢化可的松25 mg·kg-1，连续21 d[2]，对照组大鼠给予等体积的生理盐水。21 d造模结束后，空白组、模型组大鼠眼眶取血0.5 mL，置于肝素钠浸泡过的1.5 mL EP管中，4 ℃，3 000 r·min-1离心10 min，分离血浆于-20 ℃冰箱中备用；隔天处死大鼠，取肝、肾、脾、胸腺、肾上腺、睾丸及附睾称重。自愈组停止给药，正常进食进水，14 d后，同上操作。

1.4 行为学评估

1.4.1 一般四诊指标 观察各模型组大鼠实验过程中生长发育情况，精神状态，活动度，毛发，大小便情况等。

1.4.2 大鼠体重、体温检测 测定时间为实验前d 0和造模过程中的7、14、21 d，按动物序号进行测量。

1.4.3 糖水偏好[2]实验前1 d，将大鼠单笼适应24 h。d 1：给予每只大鼠2瓶1%蔗糖水；d 2：给予每只大鼠1瓶1%蔗糖水，1瓶纯净水；d 3：所有大鼠均禁食禁水23 h；d 4：给予每只大鼠事先定量的2瓶水：1瓶1%蔗糖水，1瓶纯净水，1 h后交换两瓶位置，计算大鼠在2 h内的糖水消耗量。

1.4.4 旷敞试验[2]将大鼠放入高40 cm，长、宽均为80 cm，内壁涂黑，底面平均分为25个(16×16) cm2的小方格的箱内底面中心，同时进行摄像和计时，以5 min内大鼠穿越箱底面的方格数为水平得分(三爪以上跨入)，穿越1格得1分；以双前肢抬起次数为垂直得分(两前肢离地1 cm以上)，双前肢离地1次得1分。彻底清洁敞箱后再进行下1只大鼠的观察。

1.4.5 强迫游泳试验[3]将大鼠放入直径40 cm、水深35 cm的桶内，水温25 ℃，适应2 min，累计后4 min内大鼠的不动时间。

1.5 生化指标评估

1.5.1 脏器指数测定[4]解剖动物脏器，称重，计算脏器系数，脏器系数=脏器重量/体质量×100%。

1.5.2 血浆中5-羟色胺(5-HT)、去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)含量测定

1.5.2.1 血样处理[3]取血浆100 μL，加入10 μL内标(替硝唑：5.28 mg·L-1)，加入200 μL乙腈，涡旋1 min，12 000 r·min-1离心10 min，将上清液转移至干净的EP管中，依次加入50 μL苯甲酰氯(体积分数为2%的苯甲酰氯溶于乙腈溶液中)及50 μL四硼酸钠缓冲溶液(100 mmol·L-1)，室温下微振10 min，12 000 r·min-1离心5 min，取上清100 μL于进样小瓶中，进样10 μL分析。

1.5.2.2 色谱条件 色谱柱：Agilent Zorbax SB-C18(150 mm×2.1 mm，5 μm)，美国Agilent公司；保护柱：Agilent Zorbax SB-C18(12.5 mm×2.1 mm，5 μm)，美国Agilent公司；流动相：0.1%甲酸水溶液(含2.0 mmol·L-1乙酸铵) ∶乙腈=35 ∶65；流速：0.2 mL·min-1，柱温：35 ℃。

1.5.2.3 质谱条件 多反应检测(MRM)模式；电喷雾正离子化检测(ESI+)；检测电压：3.0 kv；离子源温度：120 ℃；脱溶剂温度：350 ℃；脱溶剂气体流速：450 L·h-1。各成分的检测离子、锥孔电压、碰撞能量见Tab 1。

Tab 1 MRM parameters of three analytes and internal standards(IS)

2 结果

2.1 大鼠的生活状态 造模前各组大鼠发育正常，毛发光泽整齐，无竖毛，大小便正常，行为活跃，对外来刺激反应灵敏。空白组大鼠造模前、后一般状况无明显变化；与空白组相比，模型组大鼠生长发育缓慢，毛发枯燥无光泽，竖毛，泄泻，精神萎靡，对外来刺激反应差，行动迟缓，常蜷缩在角落。

2.2 行为学测试结果 造模过程中，模型组大鼠体质量增长缓慢，14 d时，模型组体质量明显低于对照组(P<0.05)，21 d时，模型组体质量极明显低于对照组 (P<0.01)，同时模型组大鼠的水平得分、垂直得分、糖水偏好及强迫游泳的不动时间均极明显低于对照组 (P<0.01)，模型组大鼠体温低于对照组，但无明显差异，见Tab 2。

Time/dTestitemControlgroupModelgroup0Bodyweight/mg177179Bodytemperature/℃35．235．47Bodyweight/g242235Bodytemperature/℃35．034．914Bodyweight/mg284266∗Bodytemperature/℃36．636．521Bodyweight/mg324277∗∗Bodytemperature/℃35．535．1Open⁃fieldtest Levelscore67±1338±18∗∗ Verticalscore30±1013±8∗∗Sucrosepreferencetest/%69．52±11．8547．97±14．56∗∗Forcedswimtest(immobiletime)/s59．3±14．5111．6±15．78∗∗

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

2.3 生化指标结果 ♂ SD注射氢化可的松后，肾脏、胸腺、睾丸及附睾指数明显降低(P<0.05)，脾脏指数极明显降低(P<0.01)，肝脏指数降低，但变化不明显，肾上腺指数无明显差异，见Tab 3。

2.4 样品测定 结果表明，与对照组相比，模型组大鼠血浆中5-HT、NE的含量明显或极明显升高(P<0.05,P<0.01 )，与模型组相比，自愈组大鼠血浆中5-HT、NE、DA的含量明显或极明显降低(P<0.05,P<0.01)，并且自愈组5-HT、DA的含 量明显或极明显低于正常组(P<0.05,P<0.01)，而NE含量依然高于正常组。见Tab 4。

GroupLiverKidneySpleenAdrenalglandThymusTestisandepididymisControl3．77±0．970．72±0．100．22±0．010．02±0．010．11±0．031．21±0．13Model3．50±0．240．66±0．02∗0．16±0．03∗∗0．02±0．000．08±0．03∗1．13±0．13∗Self⁃healing3．49±0．300．67±0．08∗0．16±0．02∗∗0．02±0．000．08±0．01∗1．12±0．14∗

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

Group5⁃HT/mg·L-1NE/mg·L-1DA/mg·L-1Control0．06±0．011．51±0．710．24±0．04Model0．19±0．13∗∗2．20±0．43∗0．24±0．04Self⁃healing0．04±0．01∗##1．63±0．35#0．13±0．03∗∗##

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

3 讨论

中医“证”是祖国医学理论的基本概念，也是实施中医辨证施治的基础，因此建立可靠的动物模型是深入研究疾病的前提之一。本实验采取连续21 d给予SD大鼠肌注氢化可的松25 mg·kg-1，行为学评估结果显示大鼠表现出明显的肾阳虚抑郁状态，如拱背、蜷缩、毛发疏松、无光泽、泄泻、体质量减轻、体温降低，糖水偏好降低，强迫游泳的不动时间明细延长，旷场试验的水平得分和垂直得分明显降低，与实验报道一致[5-8]，已造成肾阳虚型抑郁症模型。

病理学检查结果显示，模型大鼠的肝、肾、脾、胸腺、睾丸及附睾的脏器指数均不同程度的降低，其中脾脏指数下降极为明显，提示氢化可的松可导致大鼠肾脏、脾脏、睾丸等萎缩，生理机能减退、免疫力下降、性功能降低，说明氢化可的松导致大鼠下丘脑-垂体-性腺轴和肾上腺轴-胸腺轴功能紊乱[4,6,9]，模型大鼠出现肾阳虚型抑郁症的病理症状，停止氢化可的松刺激14 d后，受影响的脏器未能恢复正常，认为氢化可的松造成的脏器损伤可能是不可逆的。

抑郁症经典的单胺类神经递质和受体假说认为，抑郁症的发生可能与单胺类神经递质功能失衡有关，5-HT、NE、DA被认为与抑郁症发生密切相关。由于5-HT、DA及NE是内源性物质，本实验在参考文献[3]的基础上，采用活性炭预处理后的血浆作为空白血浆，排除了5-HT、NE对实验的干扰，同时大大降低了DA的干扰，保证实验数据更准确可靠。实验结果显示持续注射外源性氢化可的松可引起大鼠血浆中5-HT、NE含量明显升高，与蔡定芳等的研究结果一致[10-12]，且更早研究表明内源性糖皮质激素缺乏时支配中枢单胺类递质的神经兴奋性增高[13-14]，提示长期大剂量注射氢化可的松导致HPA轴功能低下的同时，反馈性激活中枢单胺类神经递质的合成及代谢，大鼠表现出肾阳虚抑郁状态；停止注射氢化可的松14 d后，与模型组相比，自愈组大鼠血浆中5-HT、NE及DA含量下降，并且5-HT、DA含量明显低于正常组，而NE含量依然高于正常组，杨慧敏等[15]对不同中医症型抑郁症进行研究发现，心肾不交型抑郁症5-HT、DA水平低下，NE水平相对亢进，与本实验自愈组结果一致，认为模型大鼠在14 d内不仅未能恢复正常状态，反而由肾阳虚型发展为心肾不交型，病情加重。本研究亦从单胺类神经递质含量角度初步揭示了肾阳虚型抑郁症，若久病不治，肾之精血不足，不能上养心神，最终将可能发展成心肾不交型抑郁症。

(致谢：本文实验在江苏省中医院基础药理实验室和临床药理实验室完成，特此致谢！)

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Establishment and evaluation of animal model of depression rats with kidney-yang deficiency

HE Shu-fen1, JU Wen-zheng1, HU Hao-bin2, ZHU Li-jing1, DAI Guo-liang1, ZHANG Qian1

(1.DeptofClinicalPharmacology,theAffiliatedHospitalofNanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210029,China; 2.Mesothecium,JiangsuInstituteforFoodandDrugControl,Nanjing210008,China)

Aim To establish depression rat model with kidney-yang deficiency and evaluate the related parameters. Methods A total of 24 adult SD rats were divided into control group, model group and self-healing group by body weight. Model group and self-healing group were injected hydrocortisone for 21 days, meanwhile the control group was injected sodium chloride. After modeling, the related indexs detection were taken out: open-field test, sucrose preference test and forced swim test. Then the orbital blood was taken to detect 5-HT, DA and NE by LC-MS/MS. And liver, kidney, spleen, thymus, adrenal gland, testis and epididymis were taken to calculate organ index. Results Compared with the control group, model rats displayed depression and kidney yang deficiency syndrome such as dry hairs, chills, back arched and so on. Correspondingly, the body weight increased slowly. Immobility in FST was significantly increased. Sucrose preference, horizontal scores and vertical scores was significantly decreased. Organ index decreased in liver, kidney, spleen, adrenal, testis and epididymis. The level of 5-HT and NE was significantly high. Compared with the model group, 5-HT, NE and DA were significantly reduced, 5-HT and DA were even lower than those of the control group. Conclusion Depression rat model with kidney-yang deficiency could be induced by continuous injection of hydrocortisone.

depression; kidney-yang deficiency; hydrocortisone; animal model; index detection; LC-MS/MS

时间：2016-12-27 16:13

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161227.1613.048.html

2016-09-12,

2016-11-28

国家自然科学基金资助项目(No 81573685)；江苏省中药资源产业化过程协同创新中心重点项目(No ZDXM-2)

何书芬(1989-)，女，硕士生，研究方向：中药临床药理，E-mail：l097089864@qq.com； 居文政(1965-)，男，博士，教授，博士生导师，研究方向：中药临床药物代谢动力学,通讯作者，E-mail：wzhju333@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.01.024

A

1001-1978(2017)01-0140-04

R-332；R241.3；R322.61；R363-332；R749.41