miRNAs对人皮肤成纤维细胞光老化的作用及其相关机制

薛 竞

(四川省医学科学院 四川省人民医院皮肤性病研究所，四川 成都 610072)

·基础研究·

miRNAs对人皮肤成纤维细胞光老化的作用及其相关机制

薛 竞

(四川省医学科学院 四川省人民医院皮肤性病研究所，四川 成都 610072)

目的 探讨miR-146a在紫外线诱导人皮肤成纤维细胞光老化中的作用。方法 10 J/cm2UVA连续照射成纤维细胞2 w建立光老化模型，分别于首日、3、7、14 d提取总RNA，实时定量PCR检测miR-146a表达量；慢性病毒转染上调miR-146a表达(miR-146a过表达组)，荧光显微镜观察转染效率，并验证细胞内miR-146a表达量；未经处理的成纤维细胞作为空白对照组；UVA+miR-146a组为miR-146a过表达后再用UVA照射。MTT法检测四组细胞增殖情况；实时定量PCR检测四组细胞内老化相关基因mRNA表达情况；Western印迹法检测四组细胞中Smad4蛋白表达情况。结果 UVA照射第3、7、14天UVA照射组miR-146a表达量持续降低，且明显低于同期空白对照组(P<0.05)。慢性病毒载体转染后，miR-146a过表达组第7、14天miR-146a表达量明显高于同期空白对照组(P<0.05)。UVA照射组、UVA+miR-146a组A值明显低于空白对照组、miR-146a过表达组(P<0.01);miR-146a过表达组A值与空白对照组之间无统计学差异(P>0.05)；UVA+miR-146a组A值明显高于UVA照射组(P<0.01)。UVA照射组、UVA+miR-146a组p53、p21、p16 mRNA表达量均明显高于空白对照组、miR-146a过表达组(P<0.01)；miR-146a过表达组p53、p21、p16 mRNA表达量与空白对照组之间无统计学差异(P>0.05)；UVA+miR-146a组p53、p21、p16 mRNA表达量明显低于UVA照射组(P<0.01)。UVA照射组、UVA+miR-146a组细胞内Smad4蛋白表达量明显高于空白对照组、miR-146a过表达组(P<0.01)；miR-146a过表达组与空白对照组Smad4蛋白表达量之间无统计学意义(P>0.05)；UVA+miR-146a组Smad4蛋白表达量明显低于UVA照射组(P<0.01)。结论 UVA诱导光老化人皮肤成纤维细胞中miR-146a表达被抑制，上调其表达可抑制Smad4表达，促进光老化细胞增殖，起到抗老化作用。

miRNAs；皮肤老化；成纤维细胞；miR-146a

Monteforte等〔1〕对长波紫外线(UVA)诱导成纤维细胞光老化中差异表达的miRNA进行基因芯片筛选发现miR-146a表达下调。miR-146a属于miRNAs家族，可参与细胞增殖、炎症等多种体内生物学过程。相关研究性显示，Smad4是miR-146a的靶基因，也是信号传导蛋白Smads的活性中心，编码的蛋白在组织发育、修复、再生中发挥重要作用〔2〕。本次研究中通过UVA照射建立人皮肤成纤维细胞的光老化模型，检测其中miR-146a、Smad4的表达情况，并通过慢性病毒转染上调miR-146a表达，观察其对细胞光老化的影响。

1 资料与方法

1.1 试剂与仪器 DMEM细胞培养基、胰蛋白酶、胎牛血清(上海哈灵生物科技有限公司)；Trizol、噻唑蓝(MTT)、肌动蛋白、Smad单克隆抗体(美国Sigma公司)；山羊抗小鼠IgG抗体、兔抗人Smad 4多克隆抗体(北京百奥莱博科技有限公司)；人miR-146a慢病毒表达载体、转染试剂盒(上海吉凯基因化学技术有限公司)。紫外辐射仪(北京欧普特科技有限公司)；Life ViiA 7实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)。

1.2 细胞培养 本次研究经本院伦理委员会批准，按照知情同意、自愿参加的原则，在本院泌尿外科收集包皮环切术后皮肤标本，用含双抗的磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗，除去皮下血管和脂肪，剪成2 mm×1 mm的皮条，分散酶作用下37℃消化2～3 h，分离表皮和真皮。取真皮剪碎成沫状，37℃胶原酶消化2～3 h。过200目筛，离心后将细胞重悬于培养基中，37℃ 5%CO2孵箱中培养。0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)、0.25%胰酶消化传代，取10代之内的细胞用于实验。

1.3 分组与处理 ①空白对照组：不做任何处理；②UVA照射组：给予UVA照射，并于照射后首日、3、7、14 d提取本组和空白对照组细胞的总RNA，实时荧光定量PCR检测miR-146a的表达量；③miR-146a过表达组：慢性病毒转染成纤维细胞，转然后第7、14天观察转染率，并使用实时荧光定量PCR验证胞内miR-146a表达量；④UVA+miR-146a组：慢性病毒转染成纤维细胞，用UVA照射，方法同UVA照射组。

1.4 p53、p21、p16 mRNA和miR-146a检测 Trizol试剂盒提取每组总RNA，配置反转录反应体系，总体积20 μl，37℃反转录20 min，85℃ 10 s去除反转录酶活性，得到cDNA，-20℃低温保存。染料法(SYBR Green)相对定量分析。PCR体系20 μl，包括双蒸馏水6 μl，SYBR Green 10 μl，ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μl，上、下游引物各0.8 μl，cDNA 2 μl。引物由北京三博远志生物技术有限责任公司合成。两步法实时荧光定量PCR，共40个循环。内参为β-actin，计算目的基因相对表达量。

1.5 细胞增殖活性检测 每组成纤维细胞经常规传代培养至对数期，弃去培养液，0.25%胰酶消化，观察细胞变成单个圆形时加入完全细胞培养液，吹打成单细胞悬液。置于离心管中离心10 min，弃去上清，加入培养基悬浮混匀沉淀物，细胞密度调至5×104/ml～10×104/ml。每孔加入100 μl 细胞悬液于96孔板中，调整细胞数至5×103/孔～10×103/孔。混匀后培养24 h。吸去上清，更换培养基后每孔加入5 g/L MTT溶液20 μl，培养4 h后弃去上清，加入二甲基亚砜(DMSO)150 μl/孔，振荡混匀10 min，490 nm处测定每孔的吸光度(A)值，越高则说明细胞增殖活性越强。

1.6 Smad4蛋白表达量检测 采用Western印迹法检测，10 J/cm2UVA连续照射成纤维细胞2 w建立光老化模型，培养后收集细胞，预冷的PBS洗3次，在裂解液中重悬细胞，冰浴45 min，充分裂解细胞，4℃ 10 000 r/min离心10 min，收集上清行蛋白质定量检测。每组取等量蛋白质，10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳分离后，转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，封闭后与一抗结合，4℃放于摇床过夜，Tris盐酸缓冲液(TBS)洗涤后与二抗结合，洗涤后电化学发光法(ECL)发光显示，β-actin为对照。

1.7 统计学方法 应用SPSS15.0软件，计量资料进行t检验，计数资料行χ2检验。

2 结 果

2.1 UVA照射成纤维细胞对miR-146a表达的影响 UVA照射前两组成纤维细胞miR-146a表达量无统计学差异(P>0.05)；照射第3、7、14天 UVA照射组miR-146a表达量持续降低，且明显低于同期空白对照组(P<0.05)。见表1。

表1 UVA照射不同时间点miR-146a表达量比较

与空白对照组相比:1)P<0.05

2.2 慢性病毒介导miR-146a过表达及实时定量PCR检测 慢性病毒载体转染成纤维细胞后，第7天和第14天胞内均可见较强的荧光表达。实时定量PCR检测显示：miR-146a过表达组第7天表达量为10.42±0.28，第14天为9.76±0.24，差异无统计学意义(P>0.05)；但较空白对照组第7天、第14天的表达量8.44±0.24、7.97±0.22明显升高(P<0.05)。见图1。

图1 miR-146a慢性病毒转染成纤维细胞后荧光表达情况(×100)

2.3 上调miR-146a表达对成纤维细胞增殖的影响 MTT结果显示，空白对照组、UVA照射组、miR-146a过表达组、UVA+miR-146a组吸光度(A值)分别为0.818 3±0.061 8、0.262 9±0.068 4、0.804 6±0.073 8、0.602 0±0.039 2。UVA照射组、UVA+miR-146a组A值明显低于空白对照组、miR-146a过表达组(P<0.01);miR-146a过表达组A值与空白对照组之间无统计学差异(P>0.05)；UVA+miR-146a组A值明显高于UVA照射组(P<0.01)。

2.4 上调miR-146a表达对老化相关基因的影响 UVA照射组、UVA+miR-146a组p53、p21、p16 mRNA表达量均明显高于空白对照组、miR-146a过表达组(P<0.01)；miR-146a过表达组p53、p21、p16 mRNA表达量与空白对照组之间无统计学差异(P>0.05);UVA+miR-146a组p53、p21、p16 mRNA表达量明显低于UVA照射组(P<0.01)。见表2。

2.5 miR-146a作用于靶基因Smad4的效应 空白对照组、UVA照射组、miR-146a过表达组、UVA+miR-146a组Smad4的表达量分别为0.25±0.06、1.75±0.24、0.23±0.17、0.90±0.19，见图2。UVA照射组、UVA+miR-146a组细胞内Smad4蛋白表达量明显高于空白对照组、miR-146a过表达组(P<0.01)；miR-146a过表达组与空白对照组Smad4蛋白表达量之间无统计学差异(P>0.05)；UVA+miR-146a组Smad4蛋白表达量明显低于UVA照射组(P<0.01)。

表2 UVA照射14 d后各组成纤维细胞老化

与空白对照组相比：1)P<0.01；与miR-146a过表达组相比：2)P<0.01；与UVA照射组相比：3)P<0.01

图2 Western印迹检测UVA照射14 d后各组Smad4蛋白表达情况

3 讨 论

miRNAs能够作用于特定的靶基因，从转录水平调控基因表达，目前已成功用于疾病的诊断和治疗〔3〕。miR-146，主要表达于T细胞、B细胞、巨噬细胞等〔4〕，包括miR-146a、miR-146b两个进化保守miRNA基因。miR-146a与miR-146b成熟序列只在3′端存在2个碱基的差异，功能基本相同〔5〕。本研究提示miR-146a可能作为影响人皮肤成纤维细胞光老化的靶基因。无UVA照射时，miR-146a对Smad4蛋白表达无明显影响，当接受UVA照射时，miR-146a可调控Smad4蛋白表达，使其在原有基础上明显降低。该现象的可能原因为，无UVA照射时Smad4表达处在基础水平，而miR-146a只有在应激情况下才可发挥调控作用。Smad4作为信号传到蛋白Smads的活性中心，编码的信号传导蛋白参与TGF-β超家族信号在胞内的传导。机体组织的发育、修复、再生过程中TGF-β发挥重要作用，其还可影响多种细胞因子，调节细胞的增殖、分化、凋亡。通过本次研究结果可推测miR-146a通过作用于Smad4影响TGF-β，进而发挥抗人皮肤成纤维细胞光老化的作用。

1 Monteforte R,Beilhack G,Grillari-Voglauer R,etal.SNEVhPrp19/hPSO4 haploinsufficiency accelerates premature skin aging in response to 8-methoxypsoralen/UVA treatment in mice〔J〕.J Invest Dermalol,2014;134(1):S61.

2 Kimlin MG,Guo Y.Assessing the impacts of lifetime sun exposure on skin damage and skin aging using a non-invasive method〔J〕.Sci Total Environ,2012;425(1):35-41.

3 Hazane Puch F,Bonnet M,Valenti K,etal.Study of fibroblast gene expression in response to oxidative stress induced by hydrogen peroxide or UVA with skin aging〔J〕.Eur J Dermatol EJD,2010;20(3):308-20.

4 Hung CF,Chen WY,Aljuffali IA,etal.The risk of hydroquinone and sunscreen over-absorption via photo damaged skin is not greater in senescent skin as compared to young skin:nude mouse as an animal model〔J〕.Int J Pharmaceutics,2014;471(1/2):135-45.

5 Venditti E,Bruge F,Astolfi P,etal.Nitroxides and a nitroxide-based UV filter have the potential to photoprotect UVA-irradiated human skin fibroblasts against oxidative damage〔J〕.J Dermatol Sci,2011;63(1):55-61.

〔2016-07-11修回〕

(编辑 袁左鸣)

国家“973”计划项目(No.2011CB707805)；国家临床重点专科建设项目(〔2014〕1081)；四川省国际科技合作与交流计划项目(No.2015KW-041)；四川省科技厅项目(No.2013JY0194)

薛 竞(1970-)，女，硕士，主要从事皮肤免疫研究。

R75

A

1005-9202(2017)02-0261-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.02.001