UPLC同时测定墨旱莲药材中8种成分的含量

侯雪峰+孙帅+汪刚+邱辉辉+丁淑敏+刘莹+刘丹+封亮+贾晓斌

[摘要]建立一种超高效液相色谱法同时测定墨旱莲中的异槲皮苷、木犀草苷、异去甲蟛蜞菊内酯、异绿原酸A、异绿原酸C、木犀草素、蟛蜞菊内酯、芹菜素8种成分含量的方法。采用Waters Acquity UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm ×100 mm，1.7 μm），流动相A为乙腈，B为0.1%的甲酸水，梯度洗脱条件：0～4 min，10%～13% A；4～10 min，13%～16% A；10～13 min，16%～25% A；13～17 min，25%～28% A；17～20 min，28%～40% A；20～25 min，40%～95% A。流速：0.3 mL·min^-1；柱温35 ℃；检测波长350 nm。研究结果表明各指标成分之间分离度良好，在选定的浓度范围内线性关系良好（r≥0.999 0），平均加样回收率（n=6）在96.60%～103.4%，RSD为0.86%～2.4%。所建立的UPLC同时测定墨旱蓮药材中8种指标成分的含量的方法回收率较好，重复性、稳定性良好，为墨旱莲的鉴别及质量评价提供了科学依据。

[关键词]墨旱莲； 超高液相色谱法； 多指标成分； 含量测定

[Abstract]To establish an UPLC method for the simultaneous determination of 8 compounds in Eclipta Herba， such as isoquercitrin， luteoloside， demethylwedelolactone， isochlorogenic acid A， isochlorogenic acid C， luteolin， wedelolactone and apigenin. The experiment was performed with a Waters Acquity UPLC BEH C18 （2.1 mm×100 mm， 1.7 μm） column by gradient elution of 0.1% formic acid in water and acetonitrile： 0-4 min，10%-13% A； 4-10 min， 13%-16% A； 10-13 min， 16%-25% A； 13-17 min， 25%-28% A； 17-20 min，28%-40% A；20-25 min，40%-95% A. The flow rate was 0.3 mL·min^-1 .The condition of was the colum temperature was maintained at 35 ℃ and the detected wavelength was set at 350 mm. 8 components were separated clearly by this method. Also a good linearity was obtained between the chosen concentration（r≥0.999 0）. The measured data showed that the recovery rate range from 96.60%-103.4% （n=6） and their RSD values were 0.86%-2.4%. The method has high recovery rate， good reproducibility and stability. It provides a scientific basis for the identification and quality evaluation of Eclipta Herba.

[Key words]Eclipta Herba； UPLC； multi-component quantification； content determination

doi：10.4268/cjcmm20162116

墨旱莲为菊科植物鳢肠Eclipta prostrate L.干燥地上部分^[1]，广泛分布于河南、安徽、江苏、江西、浙江、福建、广东、广西、湖南、湖北等地^[2]。其始载于《新修本草》，有滋阴益肾凉血止血之功效。现代药理研究证明，墨旱莲具有保肝益肾^[3-4]、调节免疫^[5-6]、抗氧化^[7-8]、抗菌抗炎^[9]、抗疟疾^[10]及抗肿瘤^[11-12]等作用，其主要化学成分主要有香豆草醚类、黄酮类、酚酸类等^[13]。目前《中国药典》2015年版对墨旱莲药材的质量评价依赖于蟛蜞菊内酯单一化学成分的含量测定^[1]。然而传统中药的疗效是多成分共同作用的结果，单一活性成分并不能代表药材整体的质量。近年来多指标评价墨旱莲的活性成分的报道较少，且多为2种成分同时定量^[14-15]，运用方法多为HPLC，大多集中在某一类别化学成分的评价^[16-18]。然而HPLC耗时长，其灵敏度较低，面对传统中药中低含量成分的检测问题时常常束手无策。

UPLC具有耐高压、快速分离、高灵敏度、高分离度等特点，能克服HPLC灵敏度低，分析时间长等缺点，在中药等复杂体系的分离分析上具有明显优势^[18]，被广泛地应用于中药复杂体系的研究^[19-20]。本实验首次建立了UPLC同时测定墨旱莲药材中8种活性成分含量的测定方法，该方法经试验认证安全可靠简便易行，重现性好，溶剂消耗少，为建立墨旱莲药材的质量控制与评价标准提供借鉴。

1 材料

Waters Acquity UPLC超高效液相色谱仪，包括二元梯度泵、恒温自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器（DAD）以及Waters Empower 2软件（美国 Waters 公司）。Mettler Toledo MS105DU分析天平（Mettler Toledo 分析仪器有限公司）；KQ5200DE 型数控超声仪（昆山市超声仪器有限公司）；Milli-Q超纯水机（美国Millipore公司）。

木犀草苷（批号111720-201408）、木犀草素（批号111520-201104）、蟛蜞菊内酯（批号111885-201403）、芹菜素（批号111901-201102）和异槲皮苷（批号111809-201403）均购自中国食品药品检定研究院；异去甲蟛蜞菊内酯（批号150401）、异绿原酸A（批号150311）和异绿原酸C（批号150420）均购自成都普菲德生物技术有限公司，所有对照品纯度均≥98.0%。甲醇、乙腈和甲酸均为色譜纯，购自美国TEDIA公司，水为Mlliipore超纯水。6个批次墨旱莲药材（产地为安徽亳州；批号分别为150722，150731，150804，150830，150922，151011）购于精华制药亳州康普有限公司，经南京中医药大学生药学教研室吴德康教授鉴定为菊科植物鳢肠E. prostrate的干燥地上部分。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Waters Acquity UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm ×100 mm，1.7 μm）； 流动相A为乙腈，B为0.1%的甲酸水，梯度洗脱条件：0～4 min，10%～13% A；4～10 min，13%～16% A；10～13 min，16%～25% A；13～17 min，25%～28% A；17～20 min，28%～40% A；20～25 min，40%～95% A。流速0.3 mL·min^-1；柱温35 ℃；检测波长350 nm；进样量2 μL。

2.2 混合对照品溶液的制备 分别称取异槲皮苷、木犀草苷、异去甲蟛蜞菊内酯、异绿原酸A、异绿原酸C、木犀草素、蟛蜞菊内酯、芹菜素对照品适量，精密称定，加甲醇制成对照品储备液，备用。依次精密量取上述8个对照品储备液适量置10 mL量瓶中，加80%甲醇稀释至刻度，制成含异槲皮苷42.16 mg·L^-1、木犀草苷81.60 mg·L^-1、异去甲蟛蜞菊内酯36.80 mg·L^-1、异绿原酸A 40.80 mg·L^-1、异绿原酸C 14.60 mg·L^-1、木犀草素14.20 mg·L^-1、蟛蜞菊内酯208.00 mg·L^-1、芹菜素21.60 mg·L^-1的混合对照品溶液。

2.3 供试样品溶液的制备 取墨旱莲药材粉末（过3号筛）1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入80%甲醇50 mL，密塞，称定质量；超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min后，放至室温，再次称定质量，用80%甲醇补足失重，摇匀，经0.22 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。混合对照品及供试品色谱图见图 1。

2.4 线性关系考察 分别精密移取上述混合对照品溶液，加80%甲醇稀释，稀释倍数分别为0， 2.5， 10， 20， 50， 100倍，得一系列对照品混合溶液，摇匀。在上述色谱条件下进样分析，以各成分峰面积为纵坐标（Y），质量浓度（mg·L^-1）为横坐标（X），绘制标准曲线，计算回归方程和线性范围见表 1。

2.5 检出限和定量限的测定 将2.2项下的混合对照品溶液用80%甲醇逐级稀释后，以S/N≥3～4计算检测限（LOD），以S/N≥10～12计算最小定量限（LOQ），结果见表 1。

2.6 精密度试验 日内精密度：取同一混合对照品溶液，在上述色谱条件下连续进样6次，计算异槲皮苷、木犀草苷、异去甲蟛蜞菊内酯、异绿原酸A、异绿原酸C、木犀草素、蟛蜞菊内酯、芹菜素峰面积的RSD分别为0.84%，1.2%，1.6%，0.63%，0.33%，0.81%，1.1%，1.4%。日间精密度：每天1次，以混合对照品溶液连续进样5d，计算异槲皮苷、木犀草苷、异去甲蟛蜞菊内酯、异绿原酸A、异绿原酸C、木犀草素、蟛蜞菊内酯、芹菜素峰面积的RSD分别为0.97%，1.3%，1.5%，0.93%，0.83%，1.2%，1.7%，1.9%，表明仪器精密度良好。

2.7 重复性试验 取墨旱莲药材（批号150830）粉末1 g，参照2.3项下操作，平行制备6份供试品溶液，在上述色谱条件下进行分析，计算异槲皮苷、木犀草苷、异去甲蟛蜞菊内酯、异绿原酸A、异绿原酸C、木犀草素、蟛蜞菊内酯、芹菜素峰面积的RSD分别为1.7%，2.0%，2.6%，2.3%，1.1%，1.9%，2.5%，1.3%，表明重复性良好。

2.8 稳定性试验 取墨旱莲药材（批号150830）粉末1 g，按2.3项下操作，经0.22 μm 微孔滤膜滤过至棕色量瓶中，在上述色谱条件下分别在0，2，4，6，8，12 h进样分析，计算异槲皮苷、木犀草苷、异去甲蟛蜞菊内酯、异绿原酸A、异绿原酸C、木犀草素、蟛蜞菊内酯、芹菜素峰面积的RSD 分别为0.86%，1.8%，2.2%，2.6%，1.3%，1.9%，2.3%，2.4%，表明供试品溶液在12 h 内稳定。

2.9 加样回收率试验 精密称取9份已知含量的墨旱莲药材（批号150830）粉末0.020 0 g，分别精密加入高、中、低3种浓度的对照品溶液适量（分别相当于药材原有含量的80%， 100%， 120%），每种浓度取3份，精密称定，置离心管中，加入80%甲醇2 mL，密塞，称定质量；之后操作参照2.3项下方法制成供试品溶液，在上述色谱条件下进行分析，计算平均回收率，见表2。8种被测成分回收率在96.60%～103.4%，RSD在0.86%～2.4%，表明方法回收率较好。

2.10 样品含量测定 取6个批次的墨旱莲药材粉末，参照2.3项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进行分析，每批样品平行测定2次，按照外标一点法计算各样品中8种成分的含量，结果见表3。

3 讨论

实验初期对提取溶剂进行了考察，比较了不同浓度甲醇提取物的UPLC色谱图，分别以纯水， 40%，60%， 80%， 100%的甲醇溶剂超声提取墨旱莲药材，其中以80%甲醇为提取溶剂时，色谱峰较多，且峰形好，提取效果最好。故本实验最终确定用80%甲醇提取效果最佳。

在考察流动相时，有机相分别考察乙腈和甲醇，发现乙腈的分离效果较好，而用甲醇时色谱峰重叠、峰形差。此外，还考察了流动相中酸的种类对峰形的影响，分别采用了乙腈-0.1%乙酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液以及乙腈-0.1%磷酸水溶液等流动相进行比较，结果发现在流动相中加入酸可在一定程度上改善峰形。其中，以乙腈-0.1%甲酸水溶液的峰形最佳。

从表2中可以看出不同批次的墨旱莲药材中6种成分含量差异并不是很大，可能是由于药材出自同一产地，且均在同一年的同一采收期购置得到。然而墨旱莲产区遍及全国各省^[2]，分布及其广泛，且未有道地产区的记载。不同产地由于自然资源、气候条件以及人文因素的不同^[21-22]，药材质量必将参差不齐。本课题组后续将进一步对不同产地墨旱莲中化学成分的种类、含量及其量与量之间的关系进行比较，以期建立科学系统的药材质量评价方法，确定不同产地墨旱莲药材成分的差异性。

无论单味药还是复方中药，其药效的发挥主要还是依靠组分的整体协同作用。长期以来，中药多成分及多靶点的作用特点一直被大家所认同，中药材的质量评价不能停留在单一指标性成分上，建立多指标成分的测定方法，有助于实现现代中药的多维质量控制。本实验首次利用UPLC对墨旱莲中的异槲皮苷，木犀草苷，异去甲蟛蜞菊内酯，异绿原酸A，异绿原酸C，木犀草素，蟛蜞菊内酯，芹菜素等8种成分进行同时测定，分析方法灵敏、准确、快速，重现性好，分析效率高，30 min内即可同时完成8种成分的准确测定，初步探究了墨旱莲药材的物质基础，为墨旱莲药材的评价及质量控制提供借鉴。

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[责任编辑 丁广治]