柿属6种药用植物营养期叶片辅助鉴别研究

依泽+乔娟娟+陆耕宇+吴刚+谢国勇+秦民坚

[摘要]为建立柿属药用植物的营养期辅助鉴别方法，对该属6种植物的叶片脉序、叶表皮形态、叶解剖结构、叶粉末等特征进行比较观察。结果表明所观察的该属植物叶片的二级脉与三级脉具有鉴别意义； 该属植物叶表皮皆具有单细胞非腺毛，大多具有腺毛； 个别种的粉末中可见石细胞。通过研究，获得了柿属药用植物叶片的主要区别点，并据此建立了实用的鉴别检索表，为柿属药用植物的营养期鉴定和柿叶生药基原植物的准确鉴定提供了科学依据。

[关键词]柿属； 鉴定； 叶表皮； 叶脉； 解剖特征

[Abstract]To establish a method for the identification of five species and one variety of medicinal plants fromDiospyros， their leaf veins， epidermis， anatomic and powder characters were observed and compared with macro-morphological and microscopic methods. The results indicated the differences of secondary and tertiary veins among thoseDiospyros species. The single cell non-glandular hair and glandular hair exist in most species′ epidermis while stone cells were only found in the leaf powders of two species. Through the study， the main differences of leaf macro- and micro-morphology of these species were obtained and practical keys were also established， which can provide scientific base not only for identification of these species during their vegetative stages， but also for accuracy authentication of the source of Kaki Folium.

[Key words]Diospyros； identification； leaf epidermis； leaf vein； anatomic character

doi：10.4268/cjcmm20162110

柿属Diospyros L.植物为落叶或常绿乔木或灌木，全世界约500种，主产于热带地区； 我国有57种，其中江苏省有6种，1变种^[1]。柿属植物的经济价值较大，柿D. kaki Thunb.的果实可食用，亦可入药，柿蒂为常用中药材；柿叶被收载于《中国药典》附录^[2]，具有清热解毒、润肺等作用；老鸦柿D. rhombifolia Hermsl.的根和枝入药可活血利胆等^[3]。目前对柿属植物的研究主要有化学成分、药理作用、食品饮料的开发等^[4-6]。

当前全国正在开展中药资源普查试点工作^[7]。柿属植物的营养期较长，其叶片大多椭圆状卵形或倒卵形，极易混淆。在野生药用植物外业调查过程中碰到的多是其营养生长时期，这给野外药用植物基原鉴定工作带来了一定困难。

20世纪70年代初期，Hickey等^[8-9]阐释了叶片宏观形态系统研究的内容及意义，已广泛应用于现代植物学研究，并提供了重要的分类和鉴定依据^[10-12]。植物叶片的微观形态特征是物种本身遗传特征的反应，具有一定的稳定性，在一定程度上可用于探讨属下种间关系^[13]。因此，结合以上2种技术手段，可对易混淆植物物种做出比较可信的鉴别。

本文对江苏省6种（5种1变种）柿属植物从传统的叶表皮微形态、叶解剖和叶粉末特征等进行实验观察，同时引进了植物叶片脉序的比较研究，并制定了鉴别检索表，为柿属植物生药基原的准确性鉴定提供了科学依据。

1 材料

1.1 植物

6种柿属药用植物的叶片采集自中国药科大学药用植物园、方山国家地质公园、南京市中山植物园，每种植物均采集不同成熟度的叶片，采集不少于3棵植株，经中国药科大学中药资源学教研室秦民坚教授鉴定为柿D. kaki、老鸦柿D. rhombifolia、美洲柿D. virginiana L.、油柿D. oleifera Cheng、野柿D. kaki var.silvestris Makino、山柿D. japonica Siebold et Zucc.，凭证标本保存于中药药科大学中药资源学教研室（表1）。通过同种叶片叶表观结构特征比较，对比特征出现的几率来选取最有代表性的材料。

1.2 仪器

NIKON ECLIPSE E200显微镜、HISTOSTAT 820石蜡切片机、脱影板、NIKON D7000相机。

2 方法

采集的实验材料经净制后，每种取4～5枚具有代表性的叶片制作腊叶标本作为凭证，其余叶片按如下方法处理。

2.1 透明叶的制作

为了使叶脉清晰可见，一般采取如下操作步骤（根据叶片的质地不同，具体可进行调整）：取代表性的完整新鲜叶片置于合适大小培养皿中，加适量5% NaOH溶液透化至淡茶色或颜色不再变淡。倾去培养皿中的NaOH溶液，并小心冲去叶表面残留的NaOH溶液，然后向培养皿中加入4.5%～5.5%的次氯酸鈉溶液至浸没叶片，1 min后，倾出次氯酸钠溶液（回收），加入RO（reverses osmosis， 超纯水）水浸没叶片，直至叶片颜色变白。倾去RO水，用0.5%的番红水溶液（或酸性品红溶液）均匀染于叶片上30 min左右，用流动的RO水洗去叶片表面的浮色，继续以25%，50%梯度的乙醇溶液进行脱水、分色，可使用摇床使其分色更加均匀，直至主脉与各级脉清晰可见，最后转移至脱影板上拍摄。

整体叶脉图像在背光微距拍摄后，需要在显微镜下对叶脉细微的结构进行进一步拍摄，以展示一些次级脉结构和脉附属结构。

2.2 叶表皮片的制作

取新鲜叶片，洗净，撕取上下表皮，刮去残留在上面的叶肉，以水装片，置显微镜下观察。对于亲水性差的叶片可采用水合氯醛试液装片；对于表皮难撕取的叶片，若叶片较为革质，可用薄刀片将上表皮削下，装片观察上表皮。再将中间叶肉刮去至下表皮露出，将下表皮分离下来，装片观察；若叶片较为草质，可切取不含主脉的0.5 cm×0.5 cm小块，置于5%的次氯酸钠溶液中浸泡至白色再观察；此外，还可用宽胶带撕取结合次氯酸钠离析的方法^[14]。

2.3 叶结构解剖方法

每种取10余枚新鲜叶片，每枚叶片切取含有主脉的1 cm×1 cm小块，装入FAA固定液中（福尔马林-乙酸-70%乙醇 1∶1∶18）固定24 h以上。取固定好的材料，以常规石蜡切片法切片，番红-固绿染色，得到含有主脉的叶横切面切片。

2.4 叶粉末制片的方法

每种取数十枚叶片阴干至水分小于14%，粉碎，过4号筛^[2]。取筛后的粉末适量，加水合氯醛加热透化，甘油酒精装片。

2.5 图像处理

使用显微镜系统图像处理软件，Photoshop，LEAFGUI^[15]等专业软件对获得的脉序特征、叶表皮特征、叶主脉横切面特征、叶粉末特征等图像进行分析处理，并加以描述。叶脉术语参照B Ellis等编著的《叶结构手册》^[16]。

3 结果

3.1 脉序特征

3.1.1 柿 主脉羽状，少见梳状脉。粗二级脉简单弓形，间距不规则。二级脉间三级脉为对生、V形的贯穿脉，其向轴端与中脉夹角近似直角。中脉上三级脉为对生贯穿脉，其基部与中脉夹角为锐角，顶端向基部弯曲（图1A）。四级脉呈不规则网状，五级脉呈自由分支状。游离段小脉多数不分支，少数具一个分支，具有简单的末端。边缘末级脉环状（图2A，3A）。

3.1.2 老鸦柿 主脉羽状，无梳状脉。粗二级脉花环状弓形，间距基部渐减。二级脉间三级脉呈不规则网状。中脉上三级脉网状，边缘三级脉环状（图1B）。四级脉呈不规则网状，五级脉呈自由分支状。游离段小脉多数具有1个分支，少数均等分支，具有简单的末端。边缘末级脉环状（图2B，3B）。

3.1.3 美洲柿 主脉羽状，无梳状脉。粗二级脉简单弓形，间距不规则。二级脉间三级脉呈不规则网状。中脉上三级脉网状，边缘三级脉环状（图1C）。四级脉呈不规则网状，五级脉呈自由分支状。游离段小脉多数不分支并具有简单的末端。边缘末级脉环状（图2C，3C）。

3.1.4 油柿 主脉羽状，具复合梳状脉。粗二级脉简单弓形，细二级脉简单弓形，粗二级脉间距不规则。二级脉间三级脉为对生、外凸形的贯穿脉，其向轴端与中脉夹角约为直角，角度稳定。中脉上三级脉为对生的贯穿脉，其基部与中脉夹角为锐角，顶部平行于二级脉间的三级脉。边缘三级脉环状（图1D）。四级脉呈不规则网状，五级脉呈自由分支状。游离段小脉多数具分支，并具有简单的末端。边缘末级脉环状（图2D，3D）。

3.1.5 野柿 主脉羽状，无梳状脉。粗二级脉简单弓形，间距不规则。二级脉间三级脉为对生、波状的贯穿脉，其向轴端与中脉夹角为钝角，角度不稳定。中脉上三级脉网状。边缘三级脉环状（图1E）。四级脉呈不规则网状，五级脉呈自由分支状。游离段小脉多数具1个分支，并具有简单的末端。边缘末级脉不完整（图2E，3E）。

3.1.6 山柿 主脉羽状，无梳状脉。粗二级脉简单弓形，间距不规则。二级脉间三级脉为对生、外凸的贯穿脉，其向轴端与中脉夹角为钝角，角度不稳定。中脉上三级脉网状，边缘三级脉环状（图1F）。四级脉呈不规则网状，五级脉呈自由分支状。游离段小脉多数具一个分支并具有简单的末端。边缘末级脉不完整（图2F，3F）。

3.1.7 脉序特征差异及检索表 通过观察以上特征，总结了6种植物其脉序特征的主要区别点（表2）， 并结合叶表观性状建立了鉴定检索表（表3）。其中，由于山柿和野柿的叶脉特征极其相似，但是叶形区别较大，因此在甄别两者时，引入了叶形加以辅助鉴别。

3.2 叶表皮特征

3.2.1 柿 上表皮细胞多角形，垂周壁平直，无气孔和毛茸。下表皮细胞多角形，垂周壁微弯曲；腺毛、非腺毛常见，腺毛头部1～2细胞，柄4～5细胞；非腺毛单细胞，长圆锥形，有的彎曲；气孔不定式，副卫细胞4～5个（图4A，5A）。

3.2.2 老鸦柿 上表皮细胞不规则形，垂周壁浅波状，无气孔与毛茸。下表皮细胞不规则形，垂周壁浅波状；腺毛和非腺毛多见，腺毛头部1～2细胞，柄4～6细胞；非腺毛单细胞，长圆锥形，有的弯曲；气孔不定式，副卫细胞4～6个（图4B，5B）。

3.2.3 美洲柿 上表皮细胞多角形，垂周壁平直，无气孔与毛茸。下表皮细胞形状不规则，垂周壁浅波状；非腺毛少见，单细胞，长圆锥形；气孔不定式，副卫细胞4～6个（图4C，5C）。

3.2.4 油柿 上表皮细胞多角形，垂周壁较平直。下表皮细胞形状不规则，垂周壁浅波状。腺毛和非腺毛常见与上下表皮，腺毛头部1～2细胞，柄3～4细胞；非腺毛单细胞，长圆锥形，有的弯曲。气孔只存在于下表皮，不定式，副卫细胞4～5个（图4D，5D）。

3.2.5 野柿 上表皮细胞多角形，垂周壁较平直，无气孔，但可见长条形非腺毛，单细胞。下表皮细胞类圆形，垂周壁微弯曲；腺毛、非腺毛常见，腺毛头部细胞1个，柄部细胞2～4个；非腺毛单细胞，长圆锥形，有的弯曲；气孔不定式，副卫细胞4～6个（图4E，5E）。

3.2.6 山柿 上表皮细胞多角形，垂周壁平直，无气孔和毛茸。下表皮细胞形状不规则，垂周壁微弯曲；非腺毛多见，单细胞，长圆锥形；气孔不定式，副卫细胞4～6个（图4F，5F）。

3.3 叶主脉横切面特征

3.3.1 柿 上下表皮均由1列细胞组成；下表皮常见腺毛和非腺毛。栅栏组织细胞1列，长约70～80 μm；海绵组织较厚，由6～8列细胞组成，细胞类圆形，有的细胞含草酸钙方晶。主脉维管束外韧型，呈月牙状，纤维多于韧皮部外侧聚集成束，周围薄壁细胞常含草酸钙方晶，主脉上下表皮内侧有2～3列厚角细胞（图6A）。

3.3.2 老鸦柿 叶肉栅栏组织细胞长约60～80 μm；海绵组织由4～5列细胞组成。其余特征同柿（图6B）。

3.3.3 美洲柿 下表皮偶见非腺毛，近无腺毛。叶肉栅栏组织细胞长约40～60 μm；海绵组织由4～5列细胞组成。纤维单个散在或聚集成束。其余特征同柿（图6C）。

3.3.4 油柿 上下表皮均可见腺毛和非腺毛。叶肉栅栏组织细胞长约40～45 μm；海绵组织由4～5列细胞组成。维管束与叶肉之间有石细胞，单个或成群；纤维单个散在或聚集成束。主脉上下表皮内侧有4～5列厚角细胞。其余特征同柿（图6D）。

3.3.5 野柿 上表皮少见非腺毛；下表皮可见腺毛和非腺毛。叶肉栅栏组织细胞长约40～50 μm；海绵组织由4～5列细胞组成。主脉维管束呈“U”字形，纤维单个散在或聚集成束。其余特征同柿（图6E）。

3.3.6 山柿 下表皮非腺毛，腺毛近无。栅栏组织细胞长约75～85 μm；海绵组织由5～7列细胞组成。维管束与叶肉之间有石细胞，单个或成群；纤维单个散在或聚集成束。其余特征同柿（图6F）。

3.4 叶粉末特征

3.4.1 柿 粉末深绿色。纤维常聚集成束，周围薄壁细胞中常含草酸钙方晶，形成晶鞘纤维。草酸钙方晶随处可见。导管多为梯纹。腺毛头部1～2细胞，柄4～5细胞；非腺毛单细胞，长圆锥形，弯曲（图7A）。

3.4.2 老鸦柿 粉末棕绿色。其余特征同柿（图7B）。

3.4.3 美洲柿 粉末棕绿色。纤维单个散在或聚集成束。非腺毛少见，微弯曲，腺毛近无。其余特征同柿（图7C）。

3.4.4 油柿 粉末灰绿色。纤维单个散在或聚集成束。石细胞长圆形，有的呈分枝状，壁厚。腺毛头部1～2细胞，柄3～4细胞。其余特征同柿（图7D）。

3.4.5 野柿 粉末灰绿色。纤维单个散在或聚集成束。腺毛头部细胞1个，柄部细胞2～4个。其余特征同柿（图7E）。

3.4.6 山柿 粉末污绿色。纤维单个散在或聚集成束。非腺毛微弯曲，近无腺毛。石细胞不规则形，多呈分枝状，壁厚。其余特征同柿（图7F）。

3.5 粉末特征差异及检索表

观察以上特征（3.2～3.4）总结了6种柿属植物的叶表皮特征、叶主脉横切面特征和叶粉末特征的主要区别点（表4），并以此依据建立了显微特征鉴定检索表（表5）。

4 讨论

柿叶作为传统的中草药，在民间有着长久的应用历史。柿叶不仅作为茶饮，还作为原料应用于一些常用中成药制剂当中。被2015年版《中国药典》收载的就有心舒宁片、妇炎净胶囊、脑心清片，其中脑心清片用到了柿叶提取物，并制定了相关的标准。

《中国药典》附录收载的柿叶来源为柿树D. kaki的干燥叶，但在实际药材流通过程中同属的其他植物，由于其形态的相似性，存在混同使用的可能性，这会在一定程度上造成用药基原的混乱。柿属植物的分类鉴定，主要是依据其果实的形态。如果能从植物营养器官如叶片形态上加以区分，对药材的实际采收过程，以及柿叶药材真伪鉴别等方面，都具有重要的实际应用价值。

甄汉深等^[17]研究并描述了柿叶的药材性状与粉末显微特征；严铸云^[18]从生药学的角度比较了川产柿叶与近缘种的特征区别。不同于上述的研究，本文引入了叶脉特征、表皮特征及叶解剖特征进行比较分析，并制定了基于营养器官特征的检索表。这样在药材采集中遇到柿属植物营养器官就可以通过较为简便的撕取表皮片和叶脉特征观察做出判断，对于准确用药起到辅助作用。

柿叶虽然被应用于多个中成药制剂中，但是目前只有提取物的标准。在2015年版《中国药典》中并没有“柿叶”药材的标准，这是亟待去完善的。本研究一方面对常见柿属基原植物进行营养期鉴别的研究，为其准确用药提供支持；同时也完善了柿叶药材的部分标准，为今后药典标准的制定提供了一定的依据。

叶片是植物营养器官中相对特征显著和易于观察的部位，通过研究找到一定的叶表观特征参数可区分不同的物种。由于实用性强，基于植物营养期辅助鉴别的工作近年来越来越受到重视，有学者提出了诸如“比较解剖学”、“植纹”、“脉序图谱”、“叶表皮微形态”等概念^[10，19-21]。本研究從叶脉的形态入手探讨柿属易混淆药用植物的区别，并辅助以其他的营养器官特征进行鉴别，是中药材采集、用药过程中基原快速准确判定的一种有益的尝试。

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[责任编辑 吕冬梅]