基因沉默治疗恶性肿瘤的研究进展

王正想(综述)，刘思源(审校)

(1.河北省沧州市中心医院皮肤科，河北 沧州 061001；2.河北医科大学第三医院骨与软组织肿瘤科，河北 石家庄 050051)

·综 述·

基因沉默治疗恶性肿瘤的研究进展

王正想1(综述)，刘思源2*(审校)

(1.河北省沧州市中心医院皮肤科，河北 沧州 061001；2.河北医科大学第三医院骨与软组织肿瘤科，河北 石家庄 050051)

基因沉默；肿瘤，继发原发性；综述文献

早在1985年,吴曼院士就提出了恶性肿瘤是基因治疗的重要目标，随着医学的不断进步，人们逐渐发现所有的恶性肿瘤都是基因病，都存在一个或几个不同基因的异常表达，所以从基因水平治疗恶性肿瘤一直是医学界不断追求的方向，而且近年来也取得了巨大的进展，如直肠癌可以用HLA-B7治疗，肺癌可以用p16基因治疗，神经胶质细胞瘤可用自杀基因治疗，转移性乳腺癌可以用IL-2治疗等，部分肿瘤基因治疗的临床试验已取得了一定效果。但针对单个基因的治疗一般不能取得好的效果, 因为所有肿瘤都属于多基因疾病。RNA干扰(RNA interference RNAi)技术恰恰可以弥补单基因治疗的不足，该方法能抑制多个基因的表达，能够针对信号通路的多个基因或者基因族的共同序列同时进行抑制，从而更有效地控制肿瘤生长。RNAi产生的基因沉默是由一种双链RNA(double-standed RNA,dsRNA)所诱发的。在此过程中，因为降解了与dsRNA有同源序列的信使RNA(mRNA)，因此该基因的表达受到了抑制。因RNAi所致的基因沉默发生在转录后，所以被称为转录后基因沉默(post transeriptional gene silencing，PTGS)。RNAi是一项新兴基因表达阻断技术，其优点是可以简单、快速地封闭目的基因，制备特定基因缺失的表型，以研究基因功能[1-3]。

1 基因沉默的发现

1995年，美国康奈尔大学的Guo等[4]在利用RNA反义技术研究秀丽线虫(C.elegans)的par-1基因功能时发现，将与目的基因mRNA互补的反义RNA导入线虫细胞，引起目的基因沉默。后将与mRNA序列相同的正义RNA导入细胞，出现相同的结果。1998年线虫基因组计划完成之后，马萨诸塞大学医学院的Mello和卡耐基研究院的Fire[5]发现Guo遇到的正义RNA抑制基因表达的现象，以及过去的反义RNA技术对基因表达的阻断，是由于体外转录得到的RNA中污染了微量的dsDNA造成的,首次在秀丽线虫中证明上述现象属于转录后水平的基因沉默。他们首先将体外转录得到的单链RNA(single-standed RNA,ssRNA)纯化，然后注射到线虫体内，发现基因抑制效应变的微弱。与之相反的是，经过纯化的dsRNA能够高效特异性阻断相应基因的表达，且抑制基因表达的效率较纯化前的反义RNA至少提高了2个数量级。该小组将这一现象称为RNA干涉，从此诞生了新的基因功能研究领域。

2 基因沉默的机制

RNAi引起的转录后基因沉默分为起始阶段和效应阶段：起始阶段是长链dsRNA被切割为21～23 bp长的小分子干扰RNA片段(small interfering RNA,sRNA)的过程；效应阶段是与siRNA互补的mRNA降解的过程。

2.1 起始阶段 由外源导入或者由转基因、病毒转染等途径引入的双链RNA，被Dicer酶(Dicer酶是RNaseⅢ家族的成员，广泛存在于各种生物体内。)降解为21～23bp的双链sRNA，这些sRNA具有3羟基末端、5磷酸及有2 bp的3突出端，与所作用的靶mRNA序列具有同源性，从而在RNAi调控途径中起着关键的作用。

2.2 效应阶段 在解旋酶的作用下, siRNA可解链成为正义链和反义链,其中的反义链可指导形成一种核蛋白体复合物,称之为RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)。RISC是一种核糖蛋白,包含有蛋白成分和RNA,其中的RNA即是siRNA。核酸内切酶、外切酶、解旋酶及同源RNA链等组成其蛋白成分[6]。在线虫体内,仅少量的dsRNA分子就可以引起大量mRNA的降解,并能向邻近的区域进行扩展,这表明某个信号扩散传递的现象可能存在于该过程,这种现象被称为传递RNAi。但传递RNAi现象的机制人们一直在研究。可能传递RNAi现象RNA是利用原来的siRNA作为引物重新合成dsRNA,此过程需要一个RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRP)作用,然后再通过Dicer作用成为次级siRNA,形成新的siRNA又进入上述的循环,进一步作用于靶向mRNA,这一过程也被称为随机降解性聚合酶链反应[7]。

3 基因沉默的优点

基因沉默技术具有特异性、高效性、靶点的多样性与选择性、效应的可遗传性、放大效应等特点，因而在临床中有广阔的应用空间，有望给肿瘤的治疗带来革命性的进展。

4 基因沉默干扰在各种肿瘤中的应用

4.1 基因沉默干扰在鼻咽癌治疗中的应用 疱疹病毒是导致鼻咽癌发生的重要因素，由EBV编码的LMP-1(latent membrane protein-1)与癌症的发生和转移密切相关。有研究显示以腺病毒相关病毒为载体，包装合成表达针对LMP-1的siRNA，并对EBV阳性的人类鼻咽癌C666-1细胞系感染，感染前后观察细胞存活率和跨膜侵袭能力，结果发现细胞存活率及跨膜侵袭能力在感染后明显下降[8]。在体内实验中，癌细胞转移少，肿瘤转移率降低，但肿瘤大小差异无统计学意义，不能表明抑制LMP-1后肿瘤生长受影响。RNAi可以抑制病毒癌基因的表达，能够抑制鼻咽癌癌细胞的生长，甚至使鼻咽癌癌细胞凋亡，从而降低鼻咽癌的侵袭能力，降低鼻咽癌转移的发生率。

4.2 基因沉默在肺癌治疗中的应用 随着工业化的飞速发展，环境污染也进一步加重，尤其是汽车尾气的排放，使肺癌的发病率逐渐上升，目前手术仍然是治疗肺癌的主要方法，研究肺癌的基因治疗是医学界的热点问题。Ras蛋白[9]是一种由ras基因编码的GTP结合蛋白，该蛋白具有GTP酶活性，是一种重要的信号转导分子。人类肺癌的发生与K-ras V12突变基因的表达密切相关。有研究人员用针对K-ras V12表达的siRNA对肺癌细胞系H441进行感染，结果降低了K-ras的mRNA表达量，ras蛋白表达水平也降低，转染后的细胞较对照组的细胞增殖速度降低，细胞凋亡的数目增高。在体内实验中，裸鼠肿瘤的生长也可受到siRNA的影响而被抑制。

4.3 基因沉默在卵巢癌治疗研究中的应用 卵巢的恶性肿瘤是女性生殖器三大恶性肿瘤之一。卵巢癌具有临床发现晚、转移早、治疗效果差等特点，素有“沉默杀手”之称，多数患者就诊时已处于疾病的晚期阶段，预后不良，卵巢恶性肿瘤的5年存活率仅15%左右。至今缺乏有效的早期诊断方法[10]。目前治疗卵巢癌的主要手段是手术治疗联合化疗，但其预后差，不良反应大。张国强等[11]利用基因重组技术，将PPO基因的cDNA装入pcDNA/His载体，然后对NIH/3T3细胞株进行转染，筛选出具有增殖活性并能稳定表达的单克隆细胞株，然后用PPO的RNA干扰此细胞株，结果发现PCNA的表达降低，p-MEK表达量减少。对卵巢癌细胞株OVK18和OVCAR-3进行RNAi后，注入裸鼠体内进行体内实验结果证实，实验组和对照组肿瘤的大小差异有统计学意义，表明卵巢癌细胞在活体上的生长受到抑制。目前RNAi对卵巢癌治疗的研究尚处在基础研究阶段，各种基因对卵巢癌发生发展和转移的影响，以及作用的具体途径和机制，仍需进一步研究，从基础研究阶段过渡到临床应用阶段，更需各专业学者的不断探索。

4.4 基因沉默在肝癌治疗中的应用 我国肝炎的发病率远高于其他国家。肝炎的发病率高，传播性强，而大多数肝癌都是由肝炎、肝硬化进展而形成的，因此我国肝癌的患病率居高不下。目前治疗肝癌的手段仍停留在外科手术和放疗、化疗阶段。手术切除仅限于早期，放疗和化疗不良反应大，大量科研工作者正在为寻找有效治疗肝癌的方法进行不断的探索。研究显示采用选择性COX-2抑制剂NS-398作用于肝癌细胞，RT-PCR及Western blot检测COX-2表达降低后，肝癌细胞增殖明显受到抑制[12]。有研究表明利用阳离子脂质体将COX-2 siRNA转染入肝癌细胞，MTT法观察HepG2细胞系增殖特性的变化，结果显示肝癌细胞增殖被明显抑制，尤其以转染后24 h最为显著[13]。从人肝细胞癌细胞中NF-κB p65的cDNA序列中选择3个位点作为RNAi的靶位点，以萤光素酶基因siRNA作为对照，分别转染Hep3B和SMMC-7721细胞，转染后48 h提取总RNA，用逆转录半定量PCR方法检测各组RNA的表达，结果表明在2个细胞株中，3条siRNA都能够抑制p65基因的表达，其中抑制作用最显著的是第2和第3条siRNA[14]。

4.5 基因沉默在喉癌治疗中的应用 有研究利用基因重组技术，构建蛋白激酶CKZα靶向siRNA表达质粒psiRNA-hHlneo-CKZ的脂质体，转染法转染Hep-2细胞，观察其对人喉癌细胞系Hep-2的侵袭是否有抑制作用，结果显示Hep-2细胞蛋白激酶CKZα的表达能被蛋白激酶CKZα靶向siRNA表达载体抑制， Hep-2细胞侵袭力降低[15]。实验根据hTERTcDNA序列构建特异性表达hTERTmRNA，有荧光素基因的shRNA，真核表达质粒PshRNAi，随机选取一段与人类基因无同源性的碱基序列，构建表达shRNA的含荧光素基因质粒PshRNAZ作为对照组。实验分为实验组(质粒PshRNAI)、对照组(PshRNAZ)、空白对照组(空白培养液)，各组分别转染喉癌Hep-2细胞，观察RNA干扰抑制端粒酶逆转录酶(human telome raserevese transcriptase，hTERT)能否影响喉癌Hep-2细胞凋亡、p53及caspase-3蛋白的表达。结果表明RNAi抑制hTERT基因表达后喉癌细胞增殖率降低，细胞凋亡增加，可能p53及caspase-3蛋白表达上调后诱导了细胞的凋亡[16]。目前放射治疗也是喉癌的主要治疗手段，但由于个体差异和肿瘤大小、生长部位、肿瘤分期不同，不同患者对放疗的敏感性也不同。RNAi技术应用于喉癌中可以提高癌细胞对放疗的敏感性[17]。

4.6 基因沉默在乳腺癌治疗中的应用 Gu等[18]完成针对人VEGF-C基因的siRNA表达载体的构建后,转染乳腺癌MDA-MB-43细胞，利用RNAi技术沉默VEGF-C基因。结果表明转染后VEGF-C基因及蛋白水平表达量明显减少,COX-2和Bcl-2的表达水平降低,细胞体外生长状态不佳,细胞凋亡明显增多，转染72 h后凋亡率达到60%,乳腺癌MDA-MB-43细胞的凋亡率显著高于对照组。在完成针对人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因[19]的RNAi表达载体后,利用RNAi技术沉默hTERT基因，转染乳腺癌MCF-7细胞,结果显示hTERT基因的表达降低，进而抑制乳腺癌MCF-7细胞体外生长状态，细胞凋亡率明显增加。有学者设计两对针对C35编码区的siRNA,并合成构建到转录载体pTZU6+1上,形成重组质粒siRNA-C35,通过脂质体介导转染乳腺癌细胞株T47D,结果显示质粒pTZU6+1、pshRNA-C35-1和pshRNA-C35-2组的相对表达率分别是脂质体对照组的95.3%、40.0%和28.4%[20]。siRNA转录载体转染乳腺癌细胞株能有效抑制乳腺癌细胞中C35基因的表达。

4.7 基因沉默在骨肉瘤中的应用 骨肉瘤发病率高，恶性程度大，预后极差，手术联合化疗虽然在一定程度上提高了患者的5年生存率[21]，但化疗不良反应大，且损伤人体各脏器，因此临床上迫切需要寻找骨肉瘤治疗的新方法。有研究报道，survivin基因与骨肉瘤细胞凋亡有密切关系，应用siRNA技术沉默survivin基因启动子可明显促进骨肿瘤细胞的凋亡[22]。Fossey 等[23]发现转录活化子3是骨肿瘤细胞凋亡过程中的重要细胞因子，应用siRNA技术沉默转录活化子3，结果发现可诱导骨肿瘤细胞的凋亡，细胞增殖和活力受到抑制。同时可以下调survivin、VEGF、MMP-2等相关基因的表达。有研究报道用siRNA技术进行基因沉默cyclin基因，进行骨肉瘤细胞体内外实验，结果证实基因沉默对骨肿瘤细胞的生长有一定的抑制作用[24-25]。

4.8 基因沉默在皮肤恶性肿瘤中的应用 皮肤的恶性肿瘤主要包括三类：基底细胞癌(basalcell carcinoma,BCC)、鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma,SCC)和皮肤恶性黑色素瘤(cutaneous maligant melanoma,CMM)。随着医学的不断进步，细胞生物学、分子生物学、免疫学、分子遗传学迅猛发展，对皮肤癌的治疗方法也不断改进，由最早的单纯手术和激光方法，逐渐发展到化学治疗、生物治疗、放射治疗、光动力学疗法、基因治疗。而RNAi是基因治疗的重要方法之一，这种技术的优点是可以特异性地下调致病基因，达到治疗肿瘤的目的，与其他治疗恶性肿瘤方法比较有显著的优点。凋亡蛋白抑制因子(inhibitor of apoptosis protein, IAP)是一类重要的抗细胞凋亡因子。Livin基因是新近发现的一个IAP家族成员,有2种异构体分别是α和β,在体内作用机制复杂[26-29],在多种肿瘤组织都有特异的分布[30-34]。

采用RT-PCR方法检测A375细胞等35种黑素瘤细胞株,发现 livin mRNA在各种黑素瘤细胞中都存在高表达[35]。王琳琳等[36]构建2个针对人源的siRNA的表达质粒，用脂质体介导，体外转染人恶性黑色素瘤A375细胞株，使人恶性黑色素瘤A375细胞凋亡增加，结果表明siRNA-2表达沉默Livin基因后人恶性黑色素瘤A375细胞周期出现G0/G1期的细胞增多，进入S期的细胞减少，A375细胞周期阻滞于G0/G1期，细胞增殖受到抑制，肿瘤细胞凋亡增加。

总之，RNAi能对特定基因复制表达进行高效的抑制，而对其他无关基因没有影响，因此这种方法针对性强，有很好的靶向性，不良反应小，在人类恶性肿瘤治疗方面有广阔的治疗前景。但是RNAi技术不能使所有致病基因的沉默都能达到理想效果，如何提高基因沉默的效果对该种治疗方法的有效性和可行性显得尤为重要。而且在RNAi导入后其在人体内的稳定性和作用的长期性仍需进一步完善。目前的RNAi实验大多数是在细胞和动物水平，关于人类的RNAi的临床研究还很少，因此还缺乏对其不良反应的认识和研究。但是，相信在不久的将来，关于RNAi的诸多问题会逐步得到解决，RNAi将会广泛地应用于临床工作中，以挽救广大恶性肿瘤患者的生命。

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(本文编辑：刘斯静)

2016-10-27；

2017-03-11

国家自然科学基金资助项目(30440086)

王正想(1982-)，男，河北沧州人，河北沧州市中心医院皮肤科主治医师，医学硕士，从事皮肤疾病诊治研究。

R394

A

1007-3205(2017)08-0988-05

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.08.031

*通讯作者