eNOS对糖尿病视网膜病变的研究进展

汪权志+夏媛玲

摘要：糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy ，DR）是糖尿病在眼部常见并发症，微血管的病变导致相关并发症严重影响患者视觉和生活质量。而内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）作为血管内皮细胞代谢中的限速酶，在糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy ，DR）疾病进展中可能有一定的作用。本文对内皮型一氧化氮合酶在糖尿病视网膜病变研究进展进行综述。

关键词：糖尿病视网膜病变； 内皮型一氧化氮合酶 ；血管内皮生长因子

Research Progress of Endothelial Nitric Oxide Synthase on Diabetic Retinopathy

WANG Quan-zhi1，XIA Yuan-ling2

（1.Guizhou Medical University，Guiyang 550025，Guizhou，China；2.Ophthalmology Department，The Affiliated Hospital of Guizhou Medical University，Guiyang 550000，Guizhou，China）

Abstract：Diabetic retinopathy is a common complication of diabetes in the eye， microvascular disease-related complications seriously affect the patient's visual and quality of life. Endothelial nitric oxide synthase， a rate-limiting enzyme in the metabolism of vascular endothelial cells， may play a role in the progression of diabetic retinopathy. This review summarizes the progress of endothelial nitric oxide synthase in diabetic retinopathy.

Key words：Diabetic retinopathy；Endothelial nitric oxide synthase （eNOS）；Vascular endothelial growth factor

糖尿病视网膜病变（DR）在人群中发病率逐年增高，据一项对751个数据的研究分析，到2014年全球糖尿病患病率达到4.22亿[1]。目前认为DR发病的危险因素主要包括年龄、血糖水平、血压水平、胰岛素使用及遗传等因素。DR在眼部常见于视网膜血管改变，继而导致一系列眼部并发症，如视网膜新生血管、视网膜黄斑水肿、眼底出血、视网膜脱离、新生血管性青光眼等严重危害患者视力，降低患者生活质量并带来一定的经济负担[2]。内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS） 存在于血管内皮细胞，是产生一氧化氮（nitric oxide，NO）的限速酶，而NO作为重要的血管调控因子，在DR进展中占有一定地位，现就eNOS在DR研究做一综述。

1 eNOS及NO的作用

正常生理情况下 NOS是一组同工酶，根据其不同的蛋白结构和mRNA 表达的组织特异性分为3种亚型：诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、神经型一氧化氮合酶（nNOS）和内皮型一氧化氮合酶（eNOS）[2]。其中eNOS基因位于7号染色体（7q35 36），含有26个外显子，长达21kb，编码的mRNA 包括了4，052个核苷酸[3]。经典理论认为，eNOS需要与钙调蛋白结合变构之后才能活化，而后者需要在Ca2+浓度升高的条件下才能发生变构与eNOS结合。eNOS以左旋精氨酸（L-Arg）为底物，在NOS催化下生成NO参与维持循環系统的稳态平衡。NO在体内能够维持血管的张力、微血管的完整性及通透性，且具有很强的抗血小板聚集和预防血栓形成的作用。许多心血管系统疾病，如高血压、动脉粥样硬化等都与内皮功能紊乱致NO的合成障碍密切相关。

2 eNOS基因在DR中的表现

糖尿病长期高血糖对视网膜微血管的刺激是DR主要原因，但临床也有发现部分患者血糖控制良好但也会发生DR，而有的患者长期血糖控制不佳却没有发生DR，可能遗传因素在DR发展过程起一定作用。eNOS基因可能在体内支配DR血管功能调控起重要作用。AlI MoMenI 等[4]在一项横断面调查研究中，对94例2型糖尿病视网膜病变患者与94例正常人血液行eNOS合酶基因型（TT，GT or GG）多样性分析，发现糖尿病视网膜病变患者血液中eNOS合酶基因型多样性较正常人常见。Cilen？觢ek I等[5]在一项实验组为172例增殖期糖尿病视网膜病变（proliferative diabetic retinopathy，PDR）患者，对照组为405例糖尿病但没有视网膜病变进行eNOS基因的VNTR a/b 多态性进行分析，发现携带基因型 为4a/4a的个体比基因型 4b/4a和4b/4b 的个体患PDR的风险高2.9倍。但佘重阳等[6]在eNOS基因内含子的数目可变串连重复多态性一项研究发现，eNOS基因VNTR 4a/b多态性4a/b基因型分布DR组（bb 78.5%，ab 21.5%，aa0.0%）与DWR组（bb 77.7%，ab 21.6%，aa0.7%）相比差异没有统计学意义（χ2=0.88，P=0.643）。在一项eNOS基因 a/b 多态性与DR关系多数据的Meta分析中，DR发病总体易感性与eNOS 基因 a/b 多态性无相关性，但在种族上分析中发现，eNOS 基因 a/b 多态性可能在非洲人群DR起重要作用[7]。

有研究显示糖尿病合并视网膜病变和糖尿病无病变患者中发现eNOS的基因多态性在第4内含子中无显著差异性[8]。Li Q等[9]在一项以小鼠被敲掉eNOS基因并被链脲霉素（streptozotocin STZ）诱导成糖尿病的试验研究中，发现eNOS介导内皮衍生的NO的缺乏，伴随iNOS的活化，可以产生更多NO，当遇到活性氧时，可以产生高度活性的氮物质，导致氧化应激，和加速的视网膜病变。

3 eNOS在DR眼部表现

糖尿病是一种以慢性高血糖为特征性表现的代谢性疾病，由于糖代谢紊乱可引起多系统、器官的损害。长期的高血糖刺激可引起眼睛多种组织的解剖功能及结构障碍。eNOS在眼球各层组织结构，如视网膜神经纤维和血管细胞、色素上皮细胞、虹膜等中均广泛存在，在其介导的血管舒张功能下降、血管通透性增加、炎症反应、内皮细胞脱落等病理损伤中起着重要作用。

3.1 eNOS在DR房水中特点 Sevsen Kulaks等[10]在一 项前瞻性的研究中，对患有白内障的35例增殖期2型糖尿病视网膜病变实验组与35例年龄和性别匹配对照组研究中，发现增殖期糖尿病视网膜患者房水中NO浓度与对照组有显著差异，然而增殖期糖尿病视网膜患者血清中NO浓度与对照组无明显差异。已有研究表明羟基-L-精氨酸（HOArg）是生成 NO底物。Hattenbach，L-0等[11]在一项研究中发现，房水中HOArg水平在非糖尿病和糖尿病受试者中比较，HOArg在糖尿病患者中显示出显着更高的水平，眼内NO产生的控制可能构成糖尿病性视网膜病变中的潜在治疗方法。

3.2 eNOS在DR白内障中的表现 研究发现多元醇代谢路径是糖尿病中并发白内障重要机制，糖尿病引起晶状体的高糖环境导致多元醇在晶状体内蓄积引起糖性白内障。苏文成等[12]在研究糖尿病对白内障作用机制中，发现糖尿病合并年龄相关性白内障组房水中NO含量较单纯年龄相关性白内障组高，有显著的统计学差异。

张筠等[13]在研究NOS抑制剂（硝基左旋精氨酸甲酯L-NAME）对半乳糖白内障小鼠防治作用中，随机分为对照组、模型组、L-NAME组3个组，每组各20只，模型组、L-NAME组给予50%D一半乳糖溶液，L-NAME组同时用L-NAME滴眼液点眼。30 d后摘除晶状体并行实验分析。与对照组比较，后两组NO含量明显升高，模型组晶状体NO含量较L-NAME组高，具有统计学意義。在NOS分析中模型组含量明显高于对照组，L-NAME组大鼠亦高于对照组，差异均有统计学意义。可能eNOS通过房水在糖尿病患者中介导白内障的进展中有一定作用。

3.2 eNOS在DR玻璃体中表现 PDR由于局部缺血缺氧致病理性血管在视网膜中生成，新生的血管脆性和稳定性都较生理性血管差，易导致视网膜病理性出血聚集玻璃体中，玻璃体血液机化，容易牵拉致视网膜脱离。以18例PDR患者并发视网膜脱离行玻璃体切除术作为实验组，15例尸体和3例黄斑裂孔眼行玻璃体切除术为对照组，发现实验组玻璃体中NO含量较对照组高[14]。Diederen RM等[15]通过NO代谢途径中的底物来研究NO在PDR患者中作用，通过手术过程取患者玻璃体来分析，发现NO合成途径的底物精氨酸在PDR组较对照组升高，有统计学差异。Gao L等[16]在研究NO含量在PDR患者玻璃体中病理改变，考虑到NO生物活性半衰期较短，用硝酸盐间接来测量其含量。取27例PDR需行玻璃体切除术和35例没有糖尿病但须玻璃体切除术玻璃体液分析，结果硝酸盐在PDR组较对照组玻璃体含量高（41.17±4.09μM vs. 15.22±0.86μM，P=0.000001），有显著统计学意义，间接说明NO在DR中玻璃体病变有着密切关联。而病理性新生血管在DR中常见，eNOS可能在PDR通过NO的介导在玻璃体中高表达。

3.3 eNOS与VEGF在DR中关系

3.3.1 VEGF在DR中作用 DR由于持续高血糖及其他相关因素的刺激，导致视网膜微血管发生一系列改变，以视网膜毛细血管网内皮细胞损害为主要病理改变。如视网膜微动脉瘤 、渗出、棉绒斑等，由于局部血管组织结构遭到破坏，导致视网膜缺血缺氧，进而促进新生血管的生成，而VEGF作为促血管生成因子，在DR演变中有重要作用。

Wakabayashi Y等[17]在一项检测52例PDR行玻璃体切除术后VEGF水平中，发现术后玻璃体和房水中VEGF浓度升高与并发玻璃体出血和新生血管性青光眼有关。武淑玲等[18]在一项临床试验研究中，试验组为40例PDR，对照组为40例年龄相关性白内障外无全身其他疾病患者，分别检测玻璃体、房水、血浆中 VEGF、t-PA、PAI浓度，发现PDR组玻璃体、房水中VEGF浓度较对照组升高，有显著差异。在一项印度人群中的研究中，探索VEGF 与 eNOS在DR和糖尿病不合并病视网膜病变作用，发现VEGF的5'UTR和启动子区的多态性在DR遗传中有一定作用[8]。

Abu El-Asrar AM[19]等在研究增殖期DR患者玻璃体血管生成触发因素中，实验组为34例PDR患者，其中23例患者并发视网膜脱离，13例患者合并玻璃体出血，对照组为15例孔源性视网膜脱离但没有合并增值性玻璃体视网膜病变，在行玻璃体手术过程中取2组玻璃体进行分析，sVEGFR-2在实验组较对照组有明显升高。Maugeri G等[20]在用人的REP细胞在高糖的微环境中模拟糖尿病黄斑水肿细胞，发现Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide（PACAP）and vasoactive intestinal peptide（VIP）能通过升高HIF-3α来降低HIF-1α从而来降低VEGF，从而保护黄斑水肿。DME和PDR作为DR常见并发症，在人群的研究表明，约1/3的糖尿患者群具有DR的迹象，并且约1/10有DME或PDR等并发症而威胁到视觉[21]。可见VEGF在介导以上两种并发症中扮演着重要作用。

3.3.2 eNOS与VEGF Youde Jiang等[22]在关于Compound49b（一种β-肾上腺素能受体激动剂）在减少1型糖尿病视网膜病变模型的小鼠VEGF水平研究中，通过诱导小鼠为糖尿病鼠，取小鼠视网膜内皮细胞进行不同物质对比分析，得出Compound 49b是通过增加IGFBP-3来减少VEGF的水平，而IGFBP-3主要通过在调控eNOS，PKCζ和PKCδ途径来实现。Koai E等[23]在 血管内皮生长因子是否改变内皮一氧化氮合酶转录研究中结果表明：VEGF在eNOS-mRNA上升之前快速激活eNOS转录。Qiuhua Zhang等[24]探索insulin-like growth factor binding protein-3（IGFBP-3）如何在糖尿病中降低 VEGF过程中，用人的视网膜内皮细胞分别在正常葡萄糖和高浓度葡萄糖下培养，然后转染IGFBP-3 NB 质粒，分析PKCzeta、eNOS和VEGF之间关系，发现eNOS被抑制在这个过程中起着重要作用。

García C等[25]在一项研究发现Vasoinhibins在阻止DR的过程是通过抑制eNOS磷酸化，来降低VEGF的水平。梅开等[26]也在eNOS在影响肿瘤血管生成的研究中，也发现eNOS在抑制VEGF进而影响肿瘤血管的生成。可见eNOS与VEGF相互作用，共同调控机体血管的生成。在PDR期视网膜血管供氧障碍导致新生异常血管引起眼内一系列并发症，如眼底出血、视网膜脱离、新生血管性青光眼等影响患者视力，如果在进行eNOS的靶向治疗可能会抑制DR的进展。

4 总结与展望

随着人们生活水平的提高，DR发病率越来越高，对人们视觉质量有重要的相关性。现阶段对DR的研究，特别是分子水平的研究越来越深入，关于其病理机制及各种促进因素将逐步被揭晓。eNOS在DR进展中具有重要作用，eNOS在DR的中作用机制复杂，可能与VEGF共同作用促进新生血管增生及视网膜黄斑水肿等相关并发症发生。在并发玻璃体病变中NO可能与eNOS存在某种联系，有待研究进一步的深入。糖尿病并发白内障发病率明显较普通白内障发病率高，eNOS也可能在其中发挥重要作用。关于eNOS基因研究，世界不同地区、种族有所差异，相信随着研究样本数量的增加，人们对eNOS基因在DR中作用会更加明朗。对DR的研究还任重道远，eNOS与糖尿病的眼部并发症均有明显联系，可能不久的将来会成为糖尿病眼部并发症预防和治疗的研究热点。

参考文献：

[1]ZhouB， Lu Y， Hajifathalian K， et al.Worldwide trends in diabetes since 1980： a pooled analysis of 751 population-based studies with 4·4 million participants[J].Lancent，2016，100387（27）：1513-1530.

[2]Billiar TR.Nitric oxide.Novel biology with clinical relevance[J].Ann Surg，1995 ，221（4）：339-349.

[3]Marsden PA， Heng HH， Scherer SW，et al. Structure andchromosomal localization of thehuman constitutive endothelial nitricoxide synthase gene[J]. J Biol Chem ，1993，268：17478-17488.

[4]Momeni A， Chaleshtori MH， Saadatmand S， et al.Correlation of Endothelial Nitric Oxide Synthase Gene Polymorphism （GG， TT and GT Genotype） withProteinuria and Retinopathy in Type 2 Diabetic Patients[J].J Clin Diagn Res，2016 ，10（2）：32-35.

[5]Cilenek I1，Manko S，Globonik Petrovi M，et al.GSTT1 nullgenotype is a risk factor for diabetic retinopathy in Caucasians with type 2 diabetes， whereas GSTM1 null genotype might confer protection against retinopathy[J].Dis Markers，2012， 32（2）： 93-99.

[6]佘重陽，杨秀芬，顾虹，等.内皮型一氧化氮合酶基因内含子的数目可变串联重复多态性与糖尿病视网膜病变的相关性研究[J].中华眼科杂志，2015，51（5）：338-343.

[7]曾正洪，钟莉，王敏，等.内皮型一氧化氮合酶（ eNOS ）基因 a/b 多态性与糖尿病视网膜病易感性的Meta 分析[J].中国循证医学杂志，2015，15（8）： 898-906.

[8]Suganthalakshmi B， Anand R， Kim R， et al.Association of VEGF and eNOS gene polymorphisms in type 2 diabetic retinopathy[J].Mol Vis， 2006 ，12：336-341.

[9]Li Q1， Verma A， Han PY，et al.Diabetic eNOS-knockout mice develop accelerated retinopathy[J].Invest Ophthalmol Vis Sci， 2010，51（10）：5240-5246.

[10]Kulaksizoqlu S， Karalezli A.Aqueous Humour and Serum Levels of Nitric Oxide， Malondialdehyde and Total Antioxidant Status in Patients with Type 2 Diabetes with Proliferative Diabetic Retinopathy and Nondiabetic Senile Cataracts[J].Can J Diabetes，2016，40（2）：115-119.

[11]Hattenbach LO， Allers A， Klais C， et al.L-arginine-nitric oxide pathway-related metabolites in the aqueous humor of diabetic patients[J].Invest Ophthalmol Vis Sci， 2000 ，41（1）：213-217.

[12]苏文成，杨炜，邱明磊，等.糖尿病老年性白内障血清、房水中一氧化氮与抗氧化能力的改变[J].石河子大学学报（自然科学版），2007，5（7）；599-601.

[13]张筠，何静，闰志鹏，等.一氧化氮合酶抑制剂对大鼠半乳糖性白内障的防治作用[J].中华实验眼科杂志，2013，31（4）：334-338.

[14]Yilmaz G， Esser P， Kociok NAm，et al.Elevated vitreous nitric oxide levels in patientswith proliferative diabetic retinopathy[J].Am J Ophthalmol， 2000 ，130（1）：87-90 .

[15]Diederen RM， La Heij EC， Deutz NE，et al.Increased nitric oxide （NO） pathway metabolites in the vitreous fluid of patients with rhegmatogenous retinal detachmentor diabetic traction retinal detachment[J].Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol， 2006，244（6）：683-688.

[16]Gao L， Pulido JS， Hatfield RM，et al.Capillary electrophoretic assay for nitrate levels in the vitreous of proliferative diabetic retinopathy[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci， 2007，847（2）：300-304.

[17]Wakabayashi Y1， Usui Y， Okunuki Y， et al.Immune mediators in vitreous fluids from patients with vitreoretinal B-cell lymphoma[J].Invest Ophthalmol Vis Sci， 2012，53（9）：5395-5402.

[18]武淑玲，何香莲.PDR患者血浆及眼内组织VEGF的表达与t-PA及PAI表达的相关性研究[J].中华眼科杂志，2014，50（6）：448-453.

[19]Abu El-Asrar AM1， Nawaz MI， Kangave D， et al.Angiogenic and vasculogenic factors in the vitreous from patients with proliferative diabetic retinopathy[J].J Diabetes Res， 2013，2013：539-658.

[20]Maugeri G， Grazia D'Amico A， Reitano R，et al.PACAP and VIP Inhibit the Invasiveness of Glioblastoma Cells Exposed to Hypoxia through the Regulation of HIFs and EGFR Expression[J].Front Pharmacol， 2016 ，7：139.

[21]Lamoureux EL， Wong TY.Diabetic Retinopathy in 2011： Further Insights From New Epidemiological Studies and Clinical Trials[J].Diabetes Care， 2011，34（4）：1066-1067.

[22]Jiang Y， Zhang Q， Steinle JJ.Beta-adrenergic receptor agonist decreases VEGF levels through altered eNOS and PKC signaling in diabetic retina[J].Growth Factors， 2015，33（3）：192-199.

[23]Koai E， Rios TR， Edwards J.Vascular Endothelial Growth Factor Increases EndothelialNitric Oxide Synthase Transcription In Huvec Cells[J].Webmedcentral， 2010，1（11）.

[24]Zhang Q1， Jiang Y2， Steinle JJ.IGFBP-3 reduces eNOS and PKCzeta phosphorylation， leading to lowered VEGF levels[J].Mol Vis， 2015 ，21：604-611.

[25]García C， Aranda J， Arnold E，et al.Vasoinhibins prevent retinal vasopermeability associated with diabetic retinopathy in rats via protein phosphatase 2A-dependent eNOS inactivation[J]. J Clin Invest， 2008 ，118（6）：2291-2300.

[26]梅開，蔡晓虹，杜磊，等.内皮型一氧化氮合酶来源的NO调节肿瘤血管的生成[J].癌症，2010 ，29，（1 ）：32-37.

编辑/金昊天