硫酸化海藻多糖及其生物活性研究

李晓萌，汲晨锋，季宇彬

(哈尔滨商业大学 生命科学与环境科学研究中心，哈尔滨 150076)

硫酸化海藻多糖及其生物活性研究

李晓萌，汲晨锋，季宇彬

(哈尔滨商业大学 生命科学与环境科学研究中心，哈尔滨 150076)

海藻作为一些生物活性成分的来源，近来已经获得了极大关注.硫酸化海藻多糖是具有高应用价值的天然活性物质，来自褐藻、红藻和绿藻等藻类的许多硫酸多糖被证实具有抗肿瘤、抗炎、免疫调节、抗凝血等多种生物学活性，引起广泛关注.

硫酸化多糖；硫酸化海藻多糖；生物活性

多糖是生命进程中起着十分重要作用的一类大分子物质，广泛存在于各种生物中.海藻多糖是从自然产物中分离出的，是天然的活性物质，琼脂、卡拉胶、藻酸盐、昆布多糖、硫酸鼠李聚糖和岩藻依聚糖等都是从海藻中提取的藻类多糖，被商业化生产并应用于食品、农业、医药和其他相关工业[1].其中在医药行业的研究已经颇具规模，研究成果众多.

在过去几十年中，更多人将注意力集中在多糖及其化学衍生物的研究上，特别是硫酸化衍生物的生物学活性.硫酸化多糖是一类在其羟基上具有硫酸化基团的多糖，并且与非硫酸化多糖相比，具有不同或者更强的生物活性，例如抗氧化活性、抗凝血活性、抗血栓形成、抗病毒和抗肿瘤活性、降血糖能力等.现在有明确的证据表明，硫酸化多糖的功能性质可能是受硫酸基的取代度、分子质量、以及硫酸化和糖苷酯化的位置的影响.因此，多糖的硫酸化修饰提供了新药开发的机会.据报道，许多有生物活性的硫酸多糖已显现出显著的抗肿瘤活性和低毒副作用，应用前景广阔.

许多海藻(海洋大藻类)由于其含有丰富的硫酸化多糖而引起了传统医学界的关注.海藻是非动物、非合成硫酸化多糖的最重要来源，并且这些聚合物的化学结构根据藻类的种类而变化.硫酸多糖的含量在3个主要海藻：绿藻、红藻和褐藻中不同.主要包括褐藻中的岩藻依聚糖和昆布多糖，红藻中的角叉菜胶和绿藻中的石莼多糖[2].但是由于人工提取海藻中的硫酸多糖提取率低、提取周期长，得到硫酸化多糖的方式多是对海多糖进行硫酸化修饰，即羟基被硫酸集团取代，不仅满足量化生产的要求，还大大提高了硫酸基的取代度，从而达到提高生物活性的目的.

1 多糖硫酸化修饰方法

硫酸化修饰的基本原理是：将溶于一定溶剂系统中的多糖与相应的硫酸化试剂在特定的条件下反应，多糖羟基上的-H被-SO3H取代，再通过碱中和等步骤来获得多糖硫酸盐[3].常用的方法有氯磺酸-吡啶法、浓硫酸法、三氧化硫-吡啶法、氯磺酸-二甲基甲酰胺法等[4].

1.1 氯磺酸-吡啶法

该方法常用于吡喃型多糖的硫酸化[5].在冰水浴的条件下将吡啶加入圆底烧瓶中，缓慢滴加氯磺酸，二者反应生成可用于酯化反应的酯化试剂——氯磺酸-吡啶.将干燥的多糖粉末溶解于二甲基亚砜溶液中，将氯磺酸-吡啶逐滴加入多糖-二甲基亚砜溶液中，在适宜温度下反应一段时间后，调节pH、醇沉、离心、透析、冷冻干燥得到硫酸化多糖产物.

1.2 三氧化硫-吡啶法

将一定量的吡啶加入三颈瓶中，边搅拌边加入适量三氧化硫-吡啶，加完后，在合适温度的热水浴中加热，再加入多糖粉末，反应一段时间后经冷却、调节pH、醇沉、离心、透析、冷冻干燥等步骤得到硫酸化多糖[6].

1.3 浓硫酸法

使用浓硫酸与含有硫酸铵的正丁醇(或者浓硫酸与吡啶试剂形成的混合物)作为反应介质，将无水溶剂在冰水浴中搅拌冷却，再加入干燥的多糖粉末，反应后调pH、醇沉、透析、浓缩、冷冻干燥，即得所需的多糖硫酸酯[7].

1.4 氯磺酸-二甲基甲酰胺法

此法的优点是不需要预先准备酯化试剂，酯化试剂直接以三氧化硫复合物存在，后续工作处理方便.将适量三乙胺-三氧化硫与适量N,N-二甲基甲酰胺混合于圆底烧瓶中，冰浴冷却至0 ℃，加入多糖粉末，在零度下反应24 h，反应物经中和、离心、透析、减压浓缩、醇沉、收集沉淀物、冷冻干燥等步骤后后得到硫酸化产物[8].

2 硫酸化海藻多糖的生物活性

2.1 抗肿瘤活性

硫酸化多糖的主要作用机制有：对肿瘤细胞凋亡的诱导；影响肿瘤细胞的周期；增强机体抗氧化活性；对肿瘤细胞的血管生成具有抑制作用[9].

2.1.1 诱导肿瘤细胞的凋亡

细胞的凋亡又叫细胞的程序性死亡，是由基因控制的，细胞自主有序的主动死亡过程.细胞凋亡的信号转导机制非常的复杂.目前认为至少有3条通路参与：即线粒体介导的通路、死亡受体介导的通路和内质网介导的通路，前者属于细胞外通路，后两者属于细胞内通路[10].

Yasantha Athukorala等[1]研究了从褐藻Ecklonia cava中纯化的具有高抗凝血活性的硫酸化多糖(ECSP)对人白血病单核淋巴瘤(U-937)细胞系的抗增殖活性，并通过蛋白质印迹分析研究其对凋亡相关蛋白表达的影响.实验结果显示，ECSP对caspase-7和caspase-8切割蛋白质底物具有明显的作用，包括PARP，一种负责DNA切割的凋亡诱导剂；Bax作为细胞凋亡的关键组分，在ECSP样品处理后高度表达，并且阻止细胞凋亡的Bcl-xL含量明显下降，诱导了细胞的凋亡.Qingzhi Zhai等[11]深入了解了一种棕色海藻的硫酸化多糖(LJSP)对肿瘤组织中Bcl-2和Bax蛋白表达的影响.结果表明，用LJSP处理宫颈癌细胞U-14后，观察到促凋亡蛋白Bax的水平增加和抗凋亡蛋白Bcl-2的水平显着降低，因此导致Bcl-2/ Bax比率增加，引起肿瘤细胞凋亡.

2.1.2 影响肿瘤细胞的周期

细胞的生长周期分为G0期、G1期、S期、G2期和M期.期中G1期和S期是生长周期中的关键时期，影响细胞的生长.Hossam Murad等[12]研究了藻类硫酸多糖对MDA-MB-231人乳腺癌细胞系的影响，发现藻类硫酸多糖在较低剂量(10 μg·mL-1)诱导MDA-MB-231细胞中的G1期停滞，分析后得知，低剂量的藻类硫酸多糖可引起细胞周期蛋白D1，D2和E1转录物及其相关的细胞周期蛋白依赖性激酶CDK2、CDK4和CDK6的下调，从而诱导肿瘤细胞凋亡.证明阻断肿瘤细胞的生长周期，可以达到控制肿瘤细胞生长的目的.

2.1.3 增强机体抗氧化活性

众所周知，活性自由基，包括氧自由基、非氧自由基，是正常代谢的副产物.超氧化物、羟基自由基是体内十分重要的活性氧自由基.氧细胞毒性的主要原因之一是超氧自由基，因为它是体内产生的第一个氧自由基，并且比其他自由基持续更长的时间.羟基是最活跃的自由基，其通过引发自由基链反应攻击所有生物分子.然而，过量的自由基通过脂质过氧化、DNA损伤和抑制蛋白质合成对各种生物分子具有潜在的危害.这种损伤会加速老化和引起许多疾病，如癌症、肿瘤.

Mariana等[13]通过实验证实铜绿假单胞菌的硫酸多糖有望成为预防活性氧形成的抗氧化剂，并且可能用于抗凝血治疗.抗氧化能力可通过自由基清除试验进行分析.Luiza Sheyla等[14]研究分析了来自褐藻Lobophora variegate的硫酸多糖，以通过实验分析验证了其体外抗氧化活性，这种硫酸多糖具有抗肿瘤效果.

2.1.4 对肿瘤细胞的血管生成具有抑制作用

肿瘤血管的生成的机制是在现有血管的血管内皮形成新的毛细血管，向较远的肿瘤细胞提供养分.因此抑制肿瘤细胞的血管生成对肿瘤的治疗和转移控制意义重大.有研究证明硫酸化海藻多糖可以有效抑制肿瘤细胞血管的生成和生长.

肿瘤血管生成被认为受血管生成因子、包括成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)和血管内皮生长因子(VEGF)的控制.Jun Ye等[15]研究了岩藻多糖(岩藻多糖是在几种类型的褐藻的细胞壁中发现的独特结构的硫酸多糖)提取物对人子宫颈癌HeLa细胞的血管生成的影响，发现岩藻多糖提取物抑制血管生成因子中血管内皮生长因子(VEGF)的表达和分泌，从而抑制肿瘤细胞的血管小管形成.Luiza等[16]分析了来自褐藻Lobophora variegate的硫酸多糖，岩藻糖对血管生成的作用，发现这种多糖在高抗血管生成作用和抑制肿瘤细胞系HepG-2之间的正相关.Xia Chen等[17]通过实验证实了WSS25(WGEW的硫酸化衍生物)可抑制血管生成，并发现多糖更高程度的硫酸盐取代导致更强的抑制效果，并且找到了最佳的硫酸盐取代度.

2.2 抗炎活性

Hwang等[18]人研究了来自褐藻Sargassum hemiphyllum的硫酸多糖的抗炎效果.对由脂多糖(LPS)活化的小鼠巨噬细胞细胞系(RAW 264.7)施用硫酸多糖.发现促炎细胞因子(包括IL-1b，IL-6，TNF-α和NO)的分泌在1～5 mg/mL剂量的硫酸多糖范围内显着降低.RT - PCR分析表明该硫酸多糖以剂量依赖的方式抑制IL-b，iNOS和COX-2脂多糖活化的mRNA表达.结论是硫酸多糖的抗炎性质可归因于NF-κB在细胞核中的下调.

2.3 免疫调节活性

巨噬细胞是抗细菌感染和肿瘤生长的第一线宿主防御，因此它们在适应性免疫应答的启动中起重要作用.Joung Han Yim等[19]通过含高硫酸盐的外多糖p-KG03在小鼠体内的免疫刺激作用，表明p-KG03具有免疫刺激作用并且增强巨噬细胞和NK细胞在体内的杀肿瘤活性.Qun Dong等[20]通过化学修饰非硫酸多糖制备不同类型的硫酸化多糖，然后针对不同的癌细胞系检测它们的抗肿瘤活性，并且还对NF-κB活化/抑制进行了免疫调节活性实验.结果表明，硫酸化的支链淀粉显示出强的NF-κB活化，对于PANC - 1胰腺癌细胞，活性抑制显著.

Kim等[21]人研究了使用离子交换色谱法从浒苔中提取并分馏出的水溶性硫酸化多糖，确定它们的体外和体内免疫调节活性.一些组分刺激巨噬细胞系Raw 264.7通过上调mRNA的表达诱导大量一氧化氮(NO)和各类细胞因子的产生.体内实验结果显示IFN-c和IL-2分泌增加，表明硫酸多糖是强免疫刺激剂.这暗示了硫酸多糖可以通过上调Th-1应答来激活T细胞.

2.4 抗凝血活性

近年来出现了许多关于来自海藻的硫酸化多糖具有抗凝血活性的报导.进行了从活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)、凝血酶原时间(PT)、抗凝血酶到抗凝血因子Xa活性的实验，并与肝素进行了比较.肝素因为其副作用多，开发肝素以外的抗凝血剂成为研究热点，而来自海藻的硫酸化多糖因其天然、安全的特性，受到广泛关注.

Costa等[22]通过APTT试验证实了海藻硫酸多糖的体外抗凝血活性. 藻类D.cervicornis的硫酸多糖延长了凝血时间，仅仅比克赛(一种低分子量的肝素)慢了1.4倍.Mariana等[13]通过实验证实铜绿假单胞菌的硫酸多糖可用于抗凝血治疗.

2.5 其他作用

除了上述生物活性，硫酸化海藻多糖还有许多生物活性，如降脂、抗病毒、抗菌、抗原生动物、预防增生等[23].但是其作用机理还有待进一步研究.

Kim等[24]从红海洋微藻Gyrodinium impudium中纯化了硫酸化多糖p-KG03.并表明与糖醛酸和硫酸基团街合的半乳聚糖可以抑制脑心肌炎病毒.验证了硫酸多糖对流感病毒的抑制活性.用减少细胞病变效应的MDCK细胞实验，结果证明p-KG03质量浓度为0.19～0.48 μg/mL时，对A型流感病毒的有效浓度(EC50)值是50%. p-KG03的抗病毒活性推断为与其病毒颗粒的相互作用直接相关，从而干扰其对宿主细胞的吸附和内化.

3 结 语

近年来对硫酸化海藻多糖及其生物学活性的研究和报导越来越多.由于其属于天然产物，所以凭借其副作用少和利用价值高的特点，被大量应用于食品、保健品、医药等领域，应用价值从未像现在这样受到重视，尤其在医药行业的应用，前景广阔.但是，要想实现其在医药领域的大规模应用，需要进一步的纯化和对其结构特征的分析研究，清楚、准确地阐明其作用的基本分子机制，才能被更全面的发挥其医药作用.这需要大量新兴技术、知识背景的支持，以及大量体内实验来测试它的药用可行性，仍然需要我们的不断探索.

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Advances in biological activities of sulfated polysaccharides from seaweeds

LI Xiao-meng, JI Chen-feng, JI Yu-bin

(Center of Life Science and Environmental Science, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China)

Seaweed has recently received considerable attention as a source of some bioactive components. Sulfated polysaccharide is a natural active substance with high application value. Many sulfated polysaccharides from brown algae, red algae and green algae have been proved to have many biological activities such as anti-tumor, anti-inflammation, immune regulation, anticoagulation, causing widespread concern.

sulfated polysaccharides; sulfated seaweed polysaccharide; biological activities

2016-10-25.

哈尔滨市科技创新人才杰出青年项目(2016RQYXJ014)

李晓萌(1991-)，女，硕士，研究方向：抗肿瘤药物研究.

Q949

A

1672-0946(2017)01-0011-04