O型口蹄疫液相阻断ELISA40份样品布局检测方法的探讨

王晓韩 黄春华

(重庆市石柱县畜牧兽医局疫控中心，重庆 409100)

O型口蹄疫液相阻断ELISA40份样品布局检测方法的探讨

王晓韩 黄春华

(重庆市石柱县畜牧兽医局疫控中心，重庆 409100)

近来，石柱县实施“以监定免、以检计酬”等三项制度的实施，免疫抗体质量受到广泛关注，对于血清抗体检测水平要求不断提高，作为口蹄疫液相阻断ELISA精确性、稳定性远远高于正向间接血凝试验，液相阻断ELISA广泛用于检测牛、羊、和猪偶蹄动物血清中口蹄疫O型病毒抗体，动物疫苗免疫抗体定量检测尤为广泛。但液相阻断ELISA试验操作时间长、试验过程比较烦琐容易出现试验结果偏差、不成梯度、试验失败等，因此只有熟练掌握操作步骤及注意事项，才能确保实验的成立以及最小化的误差。

O型口蹄疫 液相阻断 检测事项

1 40份样品布局

血清样品稀释后，各孔加80ul抗原，混匀。

2 40份样品布局的检测方法

（1）用包被缓冲液稀释O 型口蹄疫病毒兔抗血清至工作浓度（1：1000），在 ELISA 板上每孔加 50μl，振荡，封板或置湿盒内，室温过夜。

（2）抗原抗体（阴阳性对照血清及待检血清）反应在U型血凝板上按 50 μl/孔量用 PBST 将待检 血清从1：4开始做2倍连续稀释至 1：512。同时，按图示稀释阴阳性对照血清，然后每孔加入50 μl用 PBST 稀释到使用浓度的O型口蹄疫病毒抗原（1：4，即1份病毒抗原、加3份PBST），病毒抗原对照孔加100μl。振荡混匀，封板，4℃过夜。加入病毒抗原后血清的稀释度变为从1：8开始的2倍稀释。

（3）用洗涤液（1×PBST）洗 ELISA板5 次，在洗水纸上甩干，再将抗原抗体混合物从抗原抗体反应板上按次序转移至ELISA板上的相对应孔，每孔50μl封板，37℃温育1h。

（4）同上洗板5次，甩干。用豚鼠抗血清稀释液稀释亚洲1型口蹄疫病毒豚鼠抗血清至工作浓度（1：1000），每孔加50μl，封板，37℃温育1h。

（5）同上洗板 5 次，甩干。用 l×PBST 稀释兔抗豚鼠酶结合物至工作浓度（1：500），每孔加 50 μl封板，37 ℃温育 1 小时。

（6）同上洗板5次，每孔加50μl底物溶液（务必加过氧化氢），37℃温育15min。每孔再加50μl终止液终止反应，立即在492nm波长下读取光吸收值（OD492nm值）。

3 40份样品布局的注意事项

（1）在试验前应仔细阅读使用说明书，试剂盒使用前恢复室温10～30min，尤其是冬天应让试剂盒充分回温，避免在通风口操作。

（2）应注意阴阳性和样品加的量不一致，阴阳性为80μl，样品为5μl，病毒抗原对照控加160μl。

（3）应注意口蹄疫O型病毒抗原的工作浓度，不同批次的抗原不能混用。

（4）封膜尽量一次使用，重复利用会应影响抗体滴度，包被板在反应时严禁重叠堆放，应平铺板与板之间应有一定的间隙且不能离孵育箱太近。

（5）底物溶液使用前避光溶化，临用时每1ml底物溶液加10μl本试剂盒配的3%的过氧化氢（H2O2），底物溶液加过氧化氢前为无色透明液体且避光保存，尽量现配现用，如出现变色，弃之不用。

（6）O型、亚洲I型和A型口蹄液相阻断试剂盒的阳性血清起始浓度不一样。

（7）每批次试剂显色反应时间不一致，基本在5～15min之间，采用492nm读取结果，过短或过长都会导致OD值超过或小于抗原平均值，所以应根据底物显色情况，可以适当提前终止或延长终止时间，建议每批次试剂盒做比对试验，以便更好掌握好反应时间。

阳性对照 阴性对照1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12样品孔A(1:64) 155P+5S 155P+5S 155P+5S 155P+5S 155P+5S155P+5S 155P+5S 155P+5S 155P+5S155P+5S 80P+80S 80P+80S B(1:128) 80p 80p 80p 80p 80p 80p 80p 80p 80p 80p 80 80 C(1:64) 155P+5S 155P+5S 155P+5S 155P+5S 155P+5S155P+5S 155P+5S 155P+5S 155P+5S155P+5S 80 D(1:128) 80p 80p 80p 80p 80p 80p 80p 80p 80p 80p 80 E(1:64) 155P+5S 155P+5S 155P+5S 155P+5S 155P+5S155P+5S 155P+5S 155P+5S 155P+5S155P+5S 80 抗原孔F(1:128) 80p 80p 80p 80p 80p 80p 80p 80p 80p 80p 80 抗原孔G(1:64) 155P+5S 155P+5S 155P+5S 155P+5S 155P+5S155P+5S 155P+5S 155P+5S 155P+5S155P+5S 80 抗原孔H(1:128) 80p 80p 80p 80p 80p 80p 80p 80p 80p 80p 80 抗原孔