利用正交试验设计优化桂花的SSR-PCR体系

王 萍， 母洪娜， 耿兴敏， 杨秀莲， 王良桂

(南京林业大学风景园林学院，江苏南京 210037)

利用正交试验设计优化桂花的SSR-PCR体系

王 萍， 母洪娜， 耿兴敏， 杨秀莲， 王良桂

(南京林业大学风景园林学院，江苏南京 210037)

以潢川金桂DNA为SSR-PCR扩增模板，采用L16(45)正交设计对Taq酶用量、Mg2+浓度、模板DNA用量、dNTPs浓度以及引物浓度在4个水平上进行了优化，建立了桂花SSR-PCR反应的最佳体系，即在10 μL反应体系中，不同成分的最佳含量为Taq酶0.2 U、Mg2+3.0 mmol/L、模板DNA 40 ng、dNTPs 0.60 mmol/L、引物0.8 μmol/L。应用最佳体系对引物OfP50进行退火温度的优化，得到最适退火温度范围为60～62 ℃。

桂花；SSR-PCR；体系优化；正交设计

简单重复序列(simple sequence repeat，SSR)是一类由 1～6个碱基组成的基序串联重复而成的DNA序列[1]，其长度在100 bp以内，广泛分布于各类真核生物基因组中。SSR标记由于具有高度的重复性、丰富的多态性、共显性等优点，成为构建遗传图谱[2-3]，研究遗传多样性，分析亲缘关系[4-5]，种质鉴定[6-8]，进行分子辅助标记[9-10]、基因定位与克隆[11-12]等的理想工具。

桂花(OsmanthusfragransLour.)为木犀科木犀属常绿小乔木或灌木，是城市优良的绿化树种，也是我国十大传统名花之一。近年来，对桂花分子方面的研究主要是利用SRAP[13-14]、RAPD[15]、ISSR[16-18]、AFLP[19-20]这几种分子标记技术，以SSR分子标记对桂花开展的相关研究较少。本试验采用正交试验设计的方法对桂花SSR-PCR反应体系进行优化，以期建立一个稳定可靠的反应体系，为今后利用SSR标记技术对桂花开展进一步研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

试验桂花采自南京林业大学校园内的潢川金桂，提取其DNA作为SSR-PCR反应的模板DNA。快捷型植物基因组DNA提取试剂盒(非离心柱型)购自天根生化科技(北京)有限公司；dNTPs、Mg2+、10×Buffer(Mg2+Free)、TaqDNA聚合酶、SSR引物、Marker(DL50)均购自上海捷瑞生物工程有限公司。根据笔者前期试验，引物OfP50(5′-TTACCACCAAGATGACAGCGG-3′、5′-CCGCCCCCTTTCTCTCTCTA-3′)对于桂花具有良好的条带可读性与多态性，故选其为此次正交试验及退火温度的固定引物。

1.2 基因组DNA的提取

取生长良好的潢川金桂嫩叶，采用试剂盒的方法提取DNA。DNA的纯度和浓度测定使用NanoDrop2000超微量分光光度计，选用D260 nm/D280 nm在1.7～1.9且浓度大于 20 ng/μL 的DNA进行PCR扩增，扩增前将DNA稀释至 20 ng/μL。

1.3 PCR反应体系正交设计

选用L16(45)正交设计表，对PCR反应中5个因素(Taq酶含量、dNTPs含量、Mg2+含量、模板DNA含量、引物含量)在4个水平上进行试验，因素水平的选取参考徐沂春等的方法[21-22]并加以综合。PCR反应因素水平见表1，L16(45)设计方案见表2，本试验采用 10 μL 体系，不足体积用ddH2O补齐，试验设2次重复。

表1 优化桂花PCR反应体系的因素水平

1.4 SSR-PCR扩增

PCR扩增反应在Biometrac TPfofessional Standard PCR仪上进行。PCR反应程序：首先94 ℃预变性3 min；94 ℃变性45 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

1.5 反应产物的电泳与检测

在PCR产物中加入5 μL 0.25%溴酚蓝，然后加样，样孔中每样品点样1 μL，D50Marker为对照，用12%聚丙烯酰胺凝胶于恒压240 V电压下电泳1 h左右，再进行银染和显影，凝胶在灯光下用数码相机照相以供分析。

1.6 退火温度的筛选

采用试验确定的最佳反应体系对本次试验所用引物OfP50 的退火温度进行筛选。利用 ABI Veriti梯度PCR仪进行PCR反应程序中退火温度梯度试验。设置退火温度为 48～65 ℃，共18个梯度，对所得PCR产物进行电泳检测。

表2 优化桂花SSR-PCR反应体系L16(45)正交试验设计

1.7 最佳反应体系的检测

随机选择引物OfP16(5′-TGCATTTCTGACGCCTGGAT-3′、5′-ACCGTTGTCAAGCCCCTTTT-3′)对21份采集于南京林业大学校园同一植株的潢川金桂实生苗DNA进行SSR扩增，对优化确定的桂花SSR-PCR体系的稳定性进行检测。

2 结果与分析

2.1 正交试验

从图1可以看出，5个因素的浓度组合不同，扩增出来的效果存在明显差异。处理1、处理5、处理9没有条带；处理7、处理11、处理12、处理14、处理15、处理16扩增出了分子量小于50 bp的引物二聚体，处理15、处理16存在不同程度的杂带；处理2、处理6、处理8、处理10条带比较模糊；处理3、处理4、处理13扩增出了比较好的条带。综合考虑经济因素以及清晰度，选择处理4为最佳体系，即在10 μL反应体系中，Taq酶含量为0.2 U，Mg2+浓度为3.0 mmol/L，模板DNA含量为40 ng、dNTPs浓度为0.60 mmol/L、引物浓度为 0.8 μmol/L。

2.2 退火温度筛选

退火温度对扩增结果有较大的影响，引物在最适宜的退火温度下扩增出来的条带清晰，反之条带会模糊、拖尾。试验对引物OfP50设置了18个不同的退火温度进行PCR扩增，不同温度条件下产物的电泳结果见图2，退火温度过低，非特异性条带增多，结果不可靠；退火温度过高时，引物与模板结合差，清晰度下降。综合考虑条带数与清晰度，引物OfP50适宜的退火温度范围为60～62 ℃。

2.3 最佳反应体系稳定性检测

应用该最佳反应体系，随机选择引物OfP16对21份取自同植株的潢川金桂实生苗DNA进行扩增，从图3可以看出，21份DNA模板都扩增出了清晰目的条带，说明该体系较稳定，适用于桂花SSR-PCR反应。

3 讨论

PCR的体积对扩增效果有一定影响，体积过小，容易出现操作上的误差，体积过大，增加试验成本。本试验采用 10 μL 反应体系，得到了清晰的条带，相较王静对桂花采用的20 μL反应体系[22]，节省了试验材料，并节约了成本。

引物的退火温度对扩增效果有较大的影响，因此，采用不同的引物进行扩增反应时，须对引物进行退火温度筛选，以确定最适宜的退火温度。

正交设计的优越性就在于能均衡各个试验因素并考虑到各因素间的交互效应，在减少试验次数的同时又不使信息损失过多，可以在最短的时间内找到最优的组合[23]。很多学者在优化体系时也经常使用多次单因素设计[24-26]，这种方法虽然简便易行，但忽略了试验因素间的交互效应，因此不能完全保证各个因素的最佳浓度组合到一起就是最佳反应体系，但是结果可以作为正交设计结果的参考。

桂花SSR-PCR优化体系的建立，可为今后桂花及其他木犀科植物的群体遗传及基因型鉴定提供参考。

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10.15889/j.issn.1002-1302.2017.02.011

2016-01-12

国家科技支撑计划(编号：2013BA001B06)；江苏省高校优势学科建设工程(编号：PAPD)。

王 萍(1989—)，女，江苏常熟人，硕士，研究方向为园林植物育种。E-mail：alvawang@yeah.net。

王良桂，男，教授，博士生导师，研究方向为园林植物应用。E-mail：wlg@nifu.com.cn。

S685.130.1

A

1002-1302(2017)02-0044-03

王 萍，母洪娜，耿兴敏，等. 利用正交试验设计优化桂花的SSR-PCR体系[J]. 江苏农业科学，2017，45(2)：44-46.