23个德国鸢尾品种(系)的ISSR分析

张永侠， 缪 淼， 原海燕， 杨永恒， 刘清泉， 黄苏珍

(江苏省中国科学院植物研究所/南京中山植物园，江苏南京 210014)

23个德国鸢尾品种(系)的ISSR分析

张永侠， 缪 淼， 原海燕， 杨永恒， 刘清泉， 黄苏珍

(江苏省中国科学院植物研究所/南京中山植物园，江苏南京 210014)

以23个德国鸢尾品种(系)为材料，利用ISSR标记研究23份材料间的遗传多样性。结果表明，10条引物共获得68条清晰可辨的条带，多态性条带为61条，平均每条引物扩增出6.8条带，多态性位点百分率为89.7%；23个德国鸢尾品种(系)的平均有效等位基因数为1.897 1，平均Nei’s基因多样性指数为0.331 3，平均Shannon信息指数为0.491 1，品种间的遗传相似系数(GS)范围在0.375～0.850，变幅为0.475，说明供试材料具有丰富的遗传多样性。UPGMA聚类分析结果表明，GS值0.706时，23个德国鸢尾品种(系)可聚为5类。利用2个ISSR引物UBC814、UBC900扩增谱带构建的指纹图谱可以把23个德国鸢尾品种(系)完全区分开。

德国鸢尾；遗传多样性；ISSR；指纹图谱

德国鸢尾(IrisgermanicaL.)为鸢尾科鸢尾属多年生草本植物，是世界著名的宿根花卉之一，耐寒性强，叶丛美观，花朵硕大，色彩艳丽，具有较高的观赏价值，世界各地广为栽培[1]。德国鸢尾是栽培起源种，并非1个野生种，19世纪末20世纪初美国成为德国鸢尾的杂交育种中心，培育出许多有髯大花德国鸢尾品种[2]。ISSR是1994年Zietkiewicz等提出的一种新型分子标记技术[3]，具有操作简单、稳定性高、多态性丰富等特点。目前，ISSR分子标记已广泛应用于植物遗传多样性分析和品种鉴定[4-8]，鸢尾属植物中也有相关报道。张敏等利用RAPD及ISSR标记分析来自不同产地的鸢尾属4个野生种的遗传关系，结果表明，鸢尾属种间遗传多样性较高，且种间变异大于种内变异[9]。童俊等采用ISSR标记研究34份鸢尾属园艺品种的遗传特性及亲缘关系发现，多态性条带比例达100%，供试材料具有丰富的遗传多态性[10]。

目前，国内栽培的德国鸢尾大多引自国外，自主培育的新品种还处于起步阶段。由于对引进品种的遗传背景不了解，无法确定大部分栽培品种的亲缘关系，且经过长期的人工栽培选育，德国鸢尾存在较大的遗传分化，采用传统的分类方法很难区分其种下类群及品种。因此，运用现代分子生物学手段，从分子水平上对德国鸢尾种质资源的亲缘关系和遗传多样性开展研究，可为德国鸢尾种质资源的挖掘、创新及德国鸢尾育种中的有效利用提供依据。本研究利用ISSR分子标记技术，对23个德国鸢尾品种(系)进行遗传多样性和亲缘关系研究，旨在为德国鸢尾品种鉴定和杂交亲本选配提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试的23个德国鸢尾品种(系)均采集于江苏省中国科学院植物研究所鸢尾种质圃。12个品种于1997年引自西安植物园，引种编号分别为122、128、129、239、266、269、246、247、252、261、127、267，5个品种93E41076-8、93E41076-10、93E41078-17、93E41076-17、201425于1993年引自美国，另有6个为江苏省中国科学院植物研究所培育的新品种(系)，分别为2013001、黄金甲、幻舞、风烛、2010141、金舞娃(表1)。每个品种(系)采集1棵单株的嫩叶，置于液氮中，带回实验室-80 ℃冰箱中保存，备用。

参考加拿大哥伦比亚大学(UBC)的引物设计ISSR引物，并由上海捷瑞生物工程有限公司合成；TaqDNA聚合酶、dNTPs、Marker、10×PCR buffer等购于宝生物工程(大连)有限公司；EDC-810型-PCR扩增仪为东盛公司产品。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取与检测 采用CTAB法[11]提取基因组DNA；核酸仪检测DNA质量和浓度，并稀释至50 ng/μL。

1.2.2 引物筛选 扩增反应在EDC-810型-PCR仪上进行，用2个DNA样品分别对31条ISSR引物进行筛选，选择扩增稳定、清晰条带的引物进行正式扩增。

1.2.3 反应体系和扩增程序 通过对模板DNA浓度、Mg2+、dNTPs、Taq酶及退火温度等试验，得到2种标记的最适反应体系和扩增程序。ISSR反应体系25 μL：TaqDNA聚合酶1.0 U、模板DNA 50 ng、10×PCR buffer 2.5 μL、Mg2+1.5 mmol/L、dNTPs 0.15 mmol/L、引物0.4 μmol/L，用ddH2O补足到所需体积。扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 变性30 s，53 ℃退火45 s，72 ℃延伸120 s，38个循环；72 ℃延伸10 min。ISSR的PCR产物用质量分数2.0%琼脂糖凝胶进行电泳检测，电泳缓冲液为0.5×TBE，电泳时电压为5 V/cm；电泳结束，在上海天能科技有限公司生产的凝胶成像系统仪上观测分析并拍照。

表1 供试的23个德国鸢尾品种(系)情况

1.3 数据记录与分析

记录清晰可重复的DNA电泳条带，对同一引物的扩增产物，迁移率相同的条带记为1个位点，同一位点上有条带记为“1”，无条带记为“0”；运用NTSYS-PC 2.10e版软件计算供试材料的遗传相似系数，进行UPGMA聚类分析；采用POPGEN 1.32软件计算Shannon信息多样性指数(I)、Nei's基因多样性指数(He)及观察有效等位基因数(Ne)。

2 结果与分析

2.1 扩增产物的多态性

从31条ISSR引物中筛选出10条扩增条带清晰、重复性高的引物，图1为ISSR引物UBC880对23个德国鸢尾品种的ISSR-PCR扩增电泳。由表2可见，10条ISSR引物共扩增出68条清晰可辨条带，其中多态性条带为61条，平均多态性比率为89.7%，扩增的DNA片段集中在150～2 000 bp之间，平均每对引物扩增出6.8条带，其中6.1条具有多态性；多态性最高的为100%，低的只有75.0%。23个德国鸢尾品种(系)的GS值为0.375～0.850，变幅为0.475，不同引物的扩增产物呈现的多态性水平有较大差异。

2.2 德国鸢尾品种(系)的遗传多样性分析

通过对23个德国鸢尾品种(系)群体遗传参数进行计算，结果表明，23个德国鸢尾品种(系)平均有效等位基因数为1.897 1，平均Nei’s基因多样性指数为0.331 3，平均 Shannon 信息指数为0.491 1，这表明23个德国鸢尾品种(系)间存在丰富的遗传多样性。

2.3 23个德国鸢尾品种(系)的聚类分析

以23个德国鸢尾品种(系)的68条谱带数据建立遗传相似系数矩阵，其中，品种269与239间的遗传相似系数相对最大，为0.850；品种93E41076-17、93E41078-17与127间的遗传相似系数相对最小，仅为0.375。根据遗传相似系数矩阵，采用UPGMA法构建供试23个德国鸢尾品种(系)的聚类图。由图2可见，于遗传相似系数0.706处可将23个供试品种分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ类；Ⅰ类共包含16个品种(系)，包括4个矮型小花品种122、128、266、129，2个矮型大花品种93E41076-8、93E41076-10，10个中型大花品种(系)239、269、201425、金舞娃、幻舞、2013001、246、261、93E41076-17、93E41078-17，其中白色品种239和黄色品种269之间的遗传相似系数达到0.850，表明这2个品种具有较高的同源性；自主选育的花大色艳的黄色品种金舞娃、深紫色品种幻舞、紫色品系2013001这3个品种(系)的植株形态极其相似，被聚在一起，三者间的两两遗传相似系数平均为0.805，处于较高水平，表明这3个品种(系)也具有较高的同源性；Ⅱ、Ⅲ类均只包含1个品种，Ⅱ类为自主选育品种黄金甲，该品种外花瓣基部有红褐色条纹，观赏性较高，Ⅲ类为品种267，极矮品种，株高只有10～15 cm，外花瓣黄色，内花瓣淡紫色，花色艳丽，观赏性极高，且是培育矮生德国鸢尾的重要亲本；Ⅳ类包含247、风烛、2010141这3个品种(系)，其中风烛为自主选育品种，花型奇特，为极其少见的黑红色重瓣；Ⅴ类包含252、127这2个品种，均为高型淡紫色系品种，但两者的遗传相似系数不大。

表2 10条ISSR引物扩增结果

2.4 23个德国鸢尾品种(系)的ISSR指纹图谱构建

根据每个品种DNA扩增图谱中ISSR标记位点条带的有无或缺失，分别用0、1进行数字化统计，形成由0、1排列的字符串，构成1个数字指纹图谱。由表3可见，由引物UBC814、UBC900构建的数字指纹图谱，可以快速鉴定出23个德国鸢尾品种(系)。

3 结论与讨论

德国鸢尾的栽培品种遗传背景复杂，现在栽培的德国鸢尾至少是有10个以上亲本的园艺杂种[12]。因此，了解德国鸢尾种质资源遗传变异信息及亲缘关系远近，是培育优良品种的基础。本研究通过10条ISSR引物共在23个德国鸢尾品种(系)中扩增出68个清晰可辨位点，其中多态性位点有61个，多态位点百分率达89.7%；23个德国鸢尾品种的Nei’s遗传多样性指数为0.331 3，遗传相似系数为0.491 1，这说明德国鸢尾品种具有较为丰富的遗传多样性。

ISSR聚类分析表明，23种德国鸢尾品种(系)被划分为5类，但并没有按照花色或花型聚类，而是形态相似的品种被聚到1类，这表明基于ISSR标记对德国鸢尾品种(系)进行遗传多样性分析是可行的。自主选育的品种黄金甲和极矮生品种267分别被独自聚为1类，说明这2个品种与其他品种遗传距离相对较远；唯一的畸形重瓣品种风烛与247、2010141聚到1类，252和127形态特征相似，也被聚到1类。

花卉品种鉴定的方法主要依靠表型特征，虽然便捷，但是表型性状受环境影响较大，鉴别错误率较高，加之花卉品种资源逐年扩大，品种的相似度也越来越高，导致通过传统的表型鉴定方法来区分品种越来越难[13]。由于遗传物质DNA受环境影响较小，且多态性高，基于DNA扩增的分子标记成为花卉品种鉴定的有效方法，目前，已在丽穗凤梨、朱顶红、菊花、景东报春等花卉中构建了分子指纹图谱[5，13-15]。本研究利用引物UBC814、UBC900谱带构建的指纹图谱可将23种德国鸢尾品种(系)全部区分开来，说明ISSR是一种构建德国鸢尾种质资源指纹图谱的理想标记。

表3 引物UBC814、UBC900构建23个德国鸢尾品种(系)的特征数字指纹

[1]那伟民. 德国鸢尾栽培技术[J]. 中国花卉园艺，2007(16)：29.

[2]王振一. 德国鸢尾的栽培技术[J]. 河北林果研究，2005，20(3)：291-293.

[3]Zietkiewicz E，Rafalski A，Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification[J]. Genomics，1994，20(2)：176-183.

[4]张 林，徐迎春，成海钟，等. 基于ISSR标记的62个朱顶红品种的遗传关系分析及指纹图谱构建[J]. 植物资源与环境学报，2012，21(4)：48-54.

[5]雒新艳，王 晨，戴思兰，等. 基于ISSR标记的大菊品种资源遗传多样性分析[J]. 中国农业科学，2013，46(11)：2394-2402.

[6]刘 君，赵 琴，杨志民. ISSR分子标记对9种狗牙根的鉴定分析[J]. 草业学报，2012，21(6)：159-165.

[7]Izzatullayeva V，Akparov Z，Babayeva S A，et al. Efficiency of using RAPD and ISSR markers in evaluation of genetic diversity in sugar beet[J]. Turkish Journal of Biology，2014，38(4)：429-438.

[8]Namita，Panwar S，Sonah H，et al. Genetic diversity analysis of marigold (Tagetessp.) genotypes using RAPD and ISSR markers[J]. Indian Journal of Agricultural Sciences，2013，83(5)：8-14.

[9]张 敏，黄苏珍，仇 硕，等. 鸢尾属植物遗传多样性的RAPD和ISSR分析[J]. 植物资源与环境学报，2007，16(2)：6-11.

[10]童 俊，周 媛，毛 静，等. 鸢尾属部分园艺品种遗传多样性的ISSR分析[J]. 北方园艺，2015(10)：104-107.

[11]Chen D H，Ronald P C. A rapid DNA minipreparation method suitable for AFLP and other PCR applications[J]. Plant Molecular Biology Reporter，1999，17(1)：53-57.

[12]赵毓棠. 鸢尾欣赏与栽培利用[M]. 北京：金盾出版社，2005.

[13]葛亚英，张 飞，沈晓岚，等. 丽穗凤梨ISSR遗传多样性分析与指纹图谱构建[J]. 中国农业科学，2012，45(4)：726-733.

[14]缪恒彬，陈发棣，赵宏波，等. 应用ISSR对25个小菊品种进行遗传多样性分析及指纹图谱构建[J]. 中国农业科学，2008，41(11)：3735-3740.

[15]Xue D W，Ge X J，Hao G，et al. High genetic diversity in a rare，narrowly endemic primrose species：primula interjacens by ISSR analysis[J]. Acta Botanica Sinica，2004，46(10)：1163-1169.

10.15889/j.issn.1002-1302.2017.02.012

2015-12-14

江苏省科技支撑计划(编号：BE2012349)。

张永侠(1987—)，女，安徽阜阳人，硕士，初级实验室助理，主要从事观赏植物遗传育种研究。Tel：(025)84347086；E-mail：zhangyongxia8712@163.com。

黄苏珍，博士，研究员。E-mail：hsz1959@163.com。

S682.1+90.32

A

1002-1302(2017)02-0047-04

张永侠，缪 淼，原海燕，等. 23个德国鸢尾品种(系)的ISSR分析[J]. 江苏农业科学，2017，45(2)：47-50.