一例雏番鸭感染鸭1型甲肝病毒的诊断

卢荣辉 刘小龙 肖隆华 胡小榕 祁保民

（福建农林大学动物科学学院福州350002）

一例雏番鸭感染鸭1型甲肝病毒的诊断

卢荣辉＊刘小龙＊肖隆华 胡小榕 祁保民＊＊

（福建农林大学动物科学学院福州350002）

2016年3月，广东茂名某鸭场雏番鸭出现大量死亡，死亡雏番鸭多呈运动失调、角弓反张症状。解剖死亡雏鸭可见肝脏点状出血、肾脏肿大出血。初步诊断疑似鸭病毒性肝炎。采集病死鸭肝脏、脾脏等组织，分别进行细菌分离鉴定及病毒RT-PCR检测。结果显示，送检样品能扩增出约321 bp大小的鸭甲型肝炎病毒特异性引物条带，细菌分离为阴性。结合临床剖检症状和实验室检测结果，确诊该群雏番鸭发病的病原为鸭1型甲肝病毒。

鸭1型甲肝病毒检测诊断

鸭病毒性肝炎是由鸭甲型肝炎病毒（Duck hepatitis A virus，DHAV）引起的一种高致病性、高传播性的病毒性疫病[1]。该病以发病快、死亡率高为特征，主要感染3周龄以内的雏鸭，病死率高达80%以上，给养鸭业造成了巨大的经济损失。该病临床上主要以角弓反张、肝脏肿大出血、肾脏肿大出血为主要病变。目前发现，DHAV有3种血清型，分别为鸭甲肝病毒1型（即为传统的血清1型鸭肝炎病毒），鸭甲肝病毒2型（台湾新型DHAV-2）和鸭甲肝病毒3型（韩国新型DHAV-3）[2]，我国鸭群主要流行鸭甲肝病毒1型和3型。而近年来DHAV-1出现新的致病型（或亚型）[3]，给临床诊断及防控带来较大困难，严重影响我国水禽业的健康发展。2016年3月，广东茂名某鸭场雏番鸭发病，诊断为鸭1型甲肝病毒感染，现报道如下。

1 发病情况

2016年3月，广东省茂名市某鸭场饲养的约5 000羽20日龄雏番鸭突然发病，患鸭精神沉郁、采食量下降、眼半闭呈昏睡状态，死亡雏鸭呈角弓反张样，有的突然抽搐死亡，第2 d死亡率即达到50%。

2 剖检病变

剖检死亡雏番鸭，可见肝脏肿大、质地脆弱、有典型的点状出血；肾脏肿大、出血（见图1-图2）。

3 材料与方法

图1 肝脏肿大出血

图2 肾脏肿大出血

3.1 病料采集自病死雏鸭中无菌采集肝脏（一部分用于细菌分离）、脾脏，按照常规方法匀浆，反复冻融3次，在4℃条件下12 000 r/min离心5 min，无菌吸取上清液，于0.22 μm孔径的滤膜过滤，于-20℃冻存备用。

3.2 细菌分离与鉴定在超净工作台内取病死雏番鸭的肝脏，划线于血琼脂平板上，置37℃恒温箱中培养24 h后观察结果。

3.3 病毒的检测

3.3.1 主要试剂RNA提取试剂盒购自北京全氏金生物技术有限公司；AMV反转录酶、DL 2000 DNA Marker等试剂均购自宝生物工程（大连）有限公司；DNA提取试剂盒，dNTP Mix、Fast Pfu fly DNA聚合酶购自北京全式金生物技术有限公司。

3.3.2 引物设计根据GenBank提供的H9亚型禽流感病毒、鸭呼肠孤病毒、鹅细小病毒和鸭甲肝病毒序列，分别设计特异性引物，由生工（上海）生物工程有限公司合成。

3.3.3 病毒的PCR检测取常规处理后病料的上清液，按EasyPure Viral DNA/RNA Kit SuperMix（购自全式金生物技术有限公司）的说明书提取组织的DNA和RNA进行PCR。PCR反应体系为20 μL：2× EasyScript RT-PCR One-Step Reaction Mix 10 μL，ddH2O 7 μL，One-Step Enzyme Mix 0.4 μL，上下游引物各0.3 μL，模板2 μL。反应程序如下：45℃反转录30 min，95℃预变性5 min，按94℃30 s、54℃30 s、72℃45 s进行34个循环，最后72℃延伸5 min结束反应，取5 μL PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳检测扩增结果，观察PCR结果。

4 结果

1）经37℃恒温箱培养24 h后，血琼脂平板上未见菌落生长，可排除细菌感染。

2）分别经H9亚型禽流感病毒[4]、鸭呼肠孤病毒[5]、鹅细小病毒[6]、鸭甲肝病毒（待检样品）[7]特异性引物PCR扩增后，只有鸭甲肝病毒鸭为阳性，且扩增的目的大小与预测的相符，为321 bp（见图3）。

根据发病情况、临床诊断、剖检病变及实验室检测结果，可确诊该病例为感染鸭1型甲肝病毒。

5 讨论

鸭病毒性肝炎主要危害3周龄内的雏鸭，该病传播速度快，雏鸭一旦发病，死亡率非常高。该病最典型的临床特征是角弓反张、肝脏出血。对于该病的诊断可根据其发病特点、临床特征和剖检病理变化作出初步诊断；采集患鸭肝脏、脾脏等组织，送实验室经病毒分离鉴定和病原学检测可以作出明确诊断。目前，我国部分地区报道鸭甲肝病毒已发生变异[8]，采用传统的防治方法效果不显著。而现阶段我国对于该病的防治主要使用弱毒苗和精制高免卵黄抗体，也有的在种鸭上使用灭活苗，但对预防治疗鸭病毒性肝炎的效果上仍不尽人意，因此，关于鸭病毒性肝炎的防控仍需加强。

图3 样品的PCR检测结果（1：DL2000DNA Marker；2：H9亚型禽流感病毒；3：鸭呼肠孤病毒；4：鹅细小病毒；5：鸭1型甲肝病毒（待检样品）；6：阴性对照；7：阳性对照）

[1]Liu G Q,Wang F,Ni Z,et al.Genetic diversity of the vp1 gene of duck hepatitis virus type 1(DHV-1)isolates from southeast china is related to isolate attenuation[J].Virus Research,2008,137(1):137-141.

[2]KIM M C,KWON Y K,JOH S J,et al.Recent Korenisolates of duck hepatitis virus revealed the presence of a new geno2 and serotype when compared to duck hepatitis virus type 1 type strain[J].Arch Virol,2007,152:2059-2072.

[3]傅光华,黄瑜,傅秋玲,等.致胰腺泛黄鸭1型甲肝病毒全基因组分子特征[J].微生物学报,2014,54(9):1082-1089.

[4]万春和,林甦,施少华,等.H9亚型鸭源禽流感病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR快速检测方法的建立[J].福建农业学报,2010(4):387-391.

[5]刘伟,林贵富,谢海军,等.一例樱桃谷种鸭坦布苏病毒病与呼肠孤病毒病混合感染的诊断[J].福建畜牧兽医,2014,36 (4):70-72.

[6]万春和,潘异哲,陈红梅,等.区别鹅细小病毒和番鸭细小病毒的PCR-RFLP方法的建立[J].中国畜牧兽医,2014(9): 56-59.

[7]傅光华,陈红梅,黄瑜,等.雏番鸭胰腺型鸭1型甲肝病毒分离鉴定及VP1基因分析[J].福建农业学报,2012(9):945-950.

[8]傅秋玲,陈珍,黄瑜,等.鸭1型甲肝病毒亚型的鉴定[J].中国兽医杂志,2015(7):36-38.

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1003-4331（2017）01-0039-02

⋆卢荣辉（1991-），男，硕士研究生，研究方向：预防兽医学，E-mail：luronghui163@qq.com。⋆刘小龙（1989-），男，硕士研究生，主要从事兽医传染病防治研究，E-mail：798956657@qq.com。⋆表示对本文贡献相同。

＊＊通信作者：祁保民（1964-），男，教授，研究方向：主要从事病理学研究。