人参皂苷Rb2在大鼠体内的药代动力学行为及代谢产物研究

张喆　滕亚然　吕子燕　吴巍　刘淑莹

摘要建立快速高分离度液相色谱四极杆飞行时间质谱联用方法（RRLCQTOFMS）， 分析人参皂苷Rb2在大鼠体内的药代动力学行为， 并探索人参皂苷Rb2在大鼠体内的代谢过程。采用Agilent SBC18色谱柱， 流动相A为0.1%甲酸溶液， B为乙腈， 流速为0.2 mL/min， 进样量为5 μL， 二元线性梯度洗脱分离， 采用电喷雾负离子模式进行质谱检测。方法的检出限（S/N=3）和定量限（S/N=10）分别为0.08 μg/mL和0.1 μg/mL， 线性范围为0.10～1.26 μg/mL。结果表明， 人参皂苷Rb2静脉注射后的体内代谢过程符合二室模型特征， 血药浓度半衰期的α相（t1/2α）和β相（t1/2β）分别为（23.58±1.10）和（1306.55±147.23） min。 通过对静脉注射人参皂苷Rb2的大鼠尿液和口服后的粪便样本进行分析， 发现Rb2的代谢产物为M6， M2（CY）， F2， CK。

关键词人参皂苷Rb2； 药代动力学； 代谢产物； 液相色谱四极杆飞行时间质谱

1引 言

人参皂苷Rb2为人参（Panax ginseng C. A. Mey.）的主要活性成分之一， 含量约为6.7 mg/g[1]。研究表明， 人参皂苷Rb2能抑制地塞米松引起的细胞凋亡作用[2]， 对于小鼠在辐照诱导的造血系统损伤具有保护作用[3]。人参皂苷Rb2能够降低在高胆固醇或脂肪酸培养下的3T3L1脂肪细胞的胆固醇和三酰甘油的含量[4]。另外， 人参皂苷Rb2对物质代谢亦有一定的影响， 能够通过AMPK介导抑制糖原异生作用[5]； 能明显增加大鼠骨髓细胞DNA、蛋白质的合成， 促进血清蛋白质合成等活性[6～10]。人参皂苷在胃肠道中和酸性条件下会产生多种代谢和转化产物， 包括人参皂苷Rg3和CK等具有活性的化合物[11～13]。因此人参皂苷的药代动力学、生物和化学转化产物研究也一直备受关注， 对于揭示人参皂苷的药理作用和物质基础有重要意义， 并且直接影响人参的开发应用。Karikura等[14，15]对于人参皂苷Rb2在大鼠大肠和胃中的代谢情况进行了研究， 鉴定了氧化和去糖基化代谢产物。有文献针对口服后复方中人参皂苷Rb1、柚皮苷和人参皂苷Rb2进行了药代动力学研究[16]。但对于人参皂苷Rb2单体的大鼠体内代谢动力学和代谢产物未见报道。为了获得人参皂苷Rb2在生物体内药代动力学参数， 更好地理解其在生物体内的生物转化和排泄途径， 本研究将利用RRLCQTOF MS联用技术对大鼠静脉注射和口服人参皂苷Rb2后的血浆、尿液、粪便进行检测， 计算静脉注射后相关的药代动力学参数并分析鉴定其代谢产物。为深入研究开发人参皂苷Rb2提供理论基础， 对进一步阐明人参皂苷Rb2的生物活性提供依据。

2实验部分

2.1仪器与试剂

6520RRLCQTOF质谱仪（美国安捷伦公司）； 5804R台式高速大容量冷冻离心机（德国Eppendorf公司）； ULT13863V41超低温冰箱（美国Thermo公司）； 超纯水机（美国Millipore公司）。人参皂苷Rb2， Rf， F2， CK固体对照品（吉林大学， 纯度95%）； 甲醇、乙腈和甲酸（色谱纯， 美国TEDIA公司）； Wistar大鼠（体重（200 ± 10）g， 雄性， 购自吉林大学）。

2.2实验条件

2.2.1色谱条件Agilent SBC18色谱柱（100 mm× 3.0 mm， 1.8 μm， 600 bar）， 柱温25℃； 采用二元线性梯度洗脱： 流动相A为0.1%甲酸溶液， B为乙腈。梯度洗脱： 0～13 min， 25%～46% B； 13～19 min， 46%～50% B； 19～22 min， 50%～90% B； 22～25 min， 90% B。进样量为5 μL。

2.2.2质谱条件采用电喷雾负离子模式； 质量扫描范围m/z 100～2200； 干燥气流速（N2）为8.0 L/min； 干燥气温度为350℃； 雾化气压力为255 kPa； 碰撞电压为3500 V， 裂解电压为175 V， 锥孔电压65 V。实验数据采用安捷伦Masshunter软件（B.03.01版本）进行分析。

2.3样品的配制及样品处理

以甲醇为溶剂将Rb2和Rf（内标）标准品分别配制为100和10 μg/mL的对照品母液。4℃冷藏备用， 实验时用甲醇稀释。将不同浓度的Rb2对照品母液和Rf工作液各100 μL， 加入100 μL 空白大鼠血浆中混匀， 再加入200 μL甲醇， 涡旋1 min沉淀血浆中蛋白， 离心5 min， 取上清放入另一试管中， 最终配制成相当于Rb2浓度为0.08， 0.1， 0.2， 0.4， 0.6， 0.8， 1.0和1.3 μg/mL的血浆标准液。

2.4實验方法

选取6只大鼠分别用于Rb2静脉注射给药， 给药方式为尾静脉注射， 给药剂量为2mg/kg。分别于给药前（0时）和给药后2， 5， 10， 15， 20， 30， 40， 60和90 min和2， 4， 6， 8， 12及24 h目内眦取血， 每个时间点取血0.5 mL， 血液冷却后3000 r/min离心10 min， 取上清血浆100 μL， 测定前加入100 μL Rf内标液和300 μL甲醇， 涡旋30 s， 静置5 min， 离心10 min。取上清液， 装瓶， 待测。

选取6只大鼠， 随机分为Rb2静脉注射组和口服组， 每组3只， 静脉注射剂量为2 mg/kg， 口服剂量为50 mg/kg， 制备方法同上。以上动物给药后均放入代谢笼中收集尿液（0～24 h）和粪便（0～24 h）， 尿液样本收集后， 经氮气吹干浓缩， 水饱和正丁醇萃取， 萃取液再用氮气吹干， 经过80%甲醇提取后， 用0.45 μm微孔滤膜过滤， 最后用80%甲醇定容至1 mL， 待测； 粪便样本收集后进行研磨粉碎， 加入50 mL水溶解， 再用100 mL水饱和正丁醇分3次萃取， 萃取液放置蒸发皿中， 置水浴锅上蒸干， 然后用80%甲醇溶解并定容至1 mL， 待测。

3結果与讨论

3.1RRLCQTOFMS和MS/MS方法的优化

利用人参皂苷Rb2进行RRLCQTOFMS和MS/MS的检测方法优化。Rb2是二醇型人参皂苷（图1）， 在苷元的C3位和C20位分别为葡萄糖葡萄糖和葡萄糖阿拉伯糖取代。分别在RRLCQTOFMS正离子和负离子模式下进行测定。测定的准分子离子和碎片离子的误差小于10 ppm（图2A）， 在下文中讨论的离子的m/z数值均用整数表示。在0.1%甲酸水溶液作为流动相的条件下， Rb2在负离子模式下分别给出[M-H]

3.2方法学考察

3.2.1专属性通过比较空白与加入Rb2和内标的血浆样本的LCMS色谱考察本实验的专属性。人参皂苷Rb2和内标Rf的选择性良好， 生物基质的干扰较小， Rb2和内标Rf的保留时间分别为10.08 min和10.57 min。

3.2.2线性关系用Rb2/内标Rf的峰面积比值（Y）与Rb2含量（X）进行最小二乘线性回归， 得到标准曲线回归方程为Y=3.5174X+0.117， R2=0.9937。结果显示在0.10～1.26 μg/mL的浓度范围内线性关系良好， 检出限（S/N=3）和定量限（S/N=10）分别为0.08和0.10 μg/mL。

3.2.3精密度与准确度采用高、中、低3个浓度的Rb2血浆QC样本， 每个浓度进行6个样本分析， 连续测定3天。计算日内和日间精密度和准确度。日内和日间精密度的相对标准偏差别（RSD）均小于5%， 表明本方法的精密度和准确度良好。

3.2.4提取回收率分别取Rb2高、中、低3个浓度的QC样本， 将空白血浆中先加入Rb2， 处理后计算所测得峰面积， 与空白血浆处理后加入相同量Rb2所测得峰面积比值的百分率进行比较， 考察样品的提取回收率。结果表明， Rb2提取回收率范围为92.6%～93.4%， RSD小于15%。

4结 论

本研究建立了人参皂苷Rb2的RRLCQTOFMS 和MS/MS药代动力学和代谢产物研究方法。药代动力学研究表明人参皂苷Rb2体内分布代谢符合二室模型， 血药浓度半衰期的α相（t1/2α）和β相（t1/2β）分别为（23.576±1.103）min和（1306.545±147.226）min， 在体内有较高的血浆蛋白结合率。α相分布较快， 而β相的消除较缓慢。运用优化后的RRLCQTOFMS/MS方法， 对静脉注射和口服后人参皂苷Rb2的代谢产物进行了系统研究。结果表明， 去糖基化是人参皂苷Rb2在大鼠体内主要的代谢方式。鉴定了代谢产物M6、M2（CY）、F2和CK， 总结了大鼠在静脉注射和口服给药后Rb2尿液和粪便的代谢路径， 分别为Rb2M6M2和Rb2M6M2（CY）/F2CK代谢途径。人参皂苷Rb2的药代动力学研究和体内代谢转化研究结果为更好地理解和开发人参皂苷Rb2的应用价值提供了理论基础。

AbstractA rapid resolution liquid chromatography coupled with quadrupoletimeofflight mass spectrometric （RRLCQTOFMS） method was established and optimized for the analysis of pharmacokinetic behavior of ginsenoside Rb2 in rats by intravenous injection administration. The metabolism of ginsenosides Rb2 in vivo rat was also explored. In the experiment， Agilent SB C18 column was selected for the sample separation with 0.1% aqueous formic acid solution as mobile phase （A） and acetonitrile as mobile phase （B） at a flow rate of 0.2 mL/min， and the injection volume was set to 5 μL. QTOFMS was carried out in electron pray ionization （ESI） negative ion mode. The limit of quantification （LOQ， S/N=10） and limit of detection （LOD， S/N=3） were 0.10 and 0.08 μg/mL， respectively， and the linear range was 0.1-1.26 μg/mL. The experiment results showed that the concentrationtime profile of ginsenoside Rb2 conformed to a twocompartment pharmacokinetic model after intravenous administration for rats. The mean plasma elimination halflives were （23.58±1.10） min （t1/2α）， （1306.55±147.23） min （t1/2β） for Rb2. By analyzing the urine of rats after intravenous administration and the fecal samples after oral administration of ginsenoside Rb2， it was found that the metabolites were M6， M2（CY）， F2， and CK.

KeywordsGinsenoside Rb2； Pharmacokinetics； Metabolite； Rapid resolution liquid chromatography coupled with quadrupoletimeofflight mass spectrometry