多指标评价核桃蛋白及多肽的抗氧化活性

李丽，阮金兰，钱伟亮，周涵黎，王亚云，吴娜，刘阳，*

（1.武昌理工学院生命科学学院，生物多肽糖尿病药物湖北省协同创新中心，湖北省生物多肽糖尿病药物工程技术研究中心，湖北武汉430223；2.武汉工程大学化工与制药学院，湖北武汉430073）

多指标评价核桃蛋白及多肽的抗氧化活性

李丽1，2，阮金兰1，2，钱伟亮1，周涵黎1，2，王亚云1，2，吴娜1，2，刘阳1，2，*

（1.武昌理工学院生命科学学院，生物多肽糖尿病药物湖北省协同创新中心，湖北省生物多肽糖尿病药物工程技术研究中心，湖北武汉430223；2.武汉工程大学化工与制药学院，湖北武汉430073）

多指标评价药食两用核桃蛋白及多肽的抗氧化活性。利用DPPH·﹑O2-·﹑总还原能力和·OH 4种常用体外抗氧化活性模型，以谷胱甘肽（GSH）为对照，测定核桃蛋白及多肽抗氧化活性。在实验范围内，核桃蛋白及多肽的抗氧化活性与浓度呈量效关系，且核桃多肽对DPPH·和O2-·清除能力显著，抗氧化活性达到GSH的80%以上，对·OH清除能力亦达到GSH的50%以上。核桃蛋白及多肽均具有一定的抗氧化能力，且核桃多肽的抗氧化活性较蛋白更为显著。

核桃蛋白；核桃多肽；抗氧化活性；谷胱甘肽

多肽是由20种天然氨基酸以不同组成和排列方式通过肽键互相连接形成的分子量低于10 ku化合物的总称，已有研究表明某些动植物来源的多肽具有一定抗氧化活性，它具有安全、高效、易于消化吸收等独特优势[1]，是目前国内外药品、保健食品和化妆品领域的研究热点。核桃为四大干果之一，是药食两用果实，富含蛋白质﹑脂肪﹑碳水化合物及微量元素[2]，具有健脑益智﹑延缓衰老﹑防治心脑血管疾病﹑抑菌杀虫﹑抗氧化防癌等功效[3]。

本文在复合酶水解核桃蛋白制备核桃多肽的基础上，从二苯代苦味肼基自由基（DPPH·）﹑O2-·清除率﹑总还原能力和·OH清除率4个方面对核桃多肽与核桃蛋白的体外抗氧化能力进行比较研究，评价核桃多肽及蛋白的抗氧化活性，旨在为核桃资源的深度利用提供参考。

1 仪器与材料

1.1 材料与试剂

核桃蛋白及多肽均为武昌理工学院生物多肽糖尿病药物湖北省协同创新中心自制（核桃蛋白批号：20141204；核桃多肽批号：20141218）；DPPH（批号：M07334，BR）：成都西亚化工股份有限公司；还原性谷胱甘肽（GSH，批号：SN1108BA13，BR）：上海源叶生物科技有限公司；乙醇﹑盐酸﹑磷酸二氢钠﹑磷酸氢二钠﹑FeSO4﹑铁氰化钾﹑三氯乙酸﹑H2O2﹑邻二氮菲﹑邻苯三酚﹑三氯化铁﹑Tris：均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；水为纯化水。

1.2 仪器

pHs-3c雷磁pH计：上海仪电科学仪器有限公司；UV-1800紫外-可见分光光度计：日本岛津；UPT-II-10T优普系列超纯水器：成都超纯科技有限公司；CPA225D电子天平：赛多利斯科学仪器有限公司。

2 方法

2.1 DPPH·清除率测定

DPPH·在有机溶剂中是一种稳定的自由基，在紫外517 nm处有强吸收，加入有机清除剂后，孤对电子被配对[4]，紫外吸收减弱，因此，可通过测定紫外吸收的减弱程度来评价抗氧化剂清除能力的活性。

分别配制1.00﹑2.00﹑3.00﹑4.00﹑5.00mg/mL的GSH﹑核桃蛋白及多肽水溶液作为样品溶液，取2.0mL上述溶液，加入2.0mL 0.2mmol/LDPPH溶液（95%乙醇配制），室温放置30min，以95%乙醇调零，紫外-可见分光光度计测定其在517 nm处吸光度（A2）；同法测定2.0mL样品溶液与2.0mL 95%乙醇混合液在517 nm处吸光度（A1）以及2.0mLDPPH溶液（0.2mmol/L）与2.0mL 95%乙醇混合液在517 nm处的吸光值（A0）[5]。按公式（1）计算DPPH·清除率。

式中：A0为空白组的吸光度值；A1为样品组的吸光度值；A2为对照组的吸光度值。

采用邻苯三酚法，分别配制2.00﹑3.00﹑4.00﹑5.00﹑6.00mg/mL的GSH﹑核桃蛋白及多肽水溶液作为样品溶液。取6mL 0.05mol/LTris-HCl缓冲液（pH 8.2），分别加入上述溶液0.5mL，37℃水浴10min，加入经37℃预热的7mmol/L邻苯三酚盐酸溶液1mL，混匀，37℃反应4min，用0.5mL浓盐酸终止反应[7]。在325 nm处分别测定其吸光度值A1，以等体积pH 8.2 Tris-HCl缓冲液作为空白，测定其吸光度值A0[7]。按公式（2）计算超氧阴离子自由基清除率。

式中：A0为空白组的吸光度值；A1为样品组的吸光度值。

2.3 总还原能力测定

抗氧化成分将铁氰化钾中的Fe3+还原成Fe2+，进一步生成的普鲁士蓝在紫外700 nm处有最大吸收[8]，因此测定700 nm处紫外吸光值的大小可以间接反映样品还原能力的大小，一般情况下，样品的还原能力与抗氧化能力呈正相关[9]。

分别配制2.00﹑4.00﹑6.00﹑8.00﹑10.00 mg/mL的GSH﹑核桃蛋白及多肽水溶液，从中取1.0mL，加入1%铁氰化钾溶液2.5mL和2.5mL 0.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH 6.6），混合均匀，置于50℃水浴中反应30min，迅速冷却，加10%三氯乙酸2.5mL，4 000 r/min离心10min。取上清液2.5mL，加蒸馏水2.5mL和0.1%三氯化铁溶液2.5mL，混匀后静置10min，分别测定样品在700 nm处的吸光值[8]。

2.4 ·OH清除率测定

H2O2在Fe2+催化下分解成·OH，邻二氮菲-Fe2+被·OH氧化成邻二氮菲-Fe3+，于是邻二氮菲-Fe2+络合物在紫外510 nm处最大吸收峰消失，当向反应体系中加入抗氧化成分后，·OH将被全部或部分清除，邻二氮菲-Fe2+络合物的损伤将会减少[10]。据此，可建立样品抗氧化活性与邻二氮菲-Fe2+络合物在510 nm处吸光度的关系。

采用邻二氮菲-Fe2+氧化法，分别配制2.00﹑4.00﹑6.00﹑8.00﹑10.00mg/mL的GSH﹑核桃蛋白及多肽水溶液作为样品溶液。量取1.5mL 5mmol/L邻二氮菲溶液，依次加入0.5mol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.4）4.0mL﹑7mmol/LFeSO4溶液1.0mL﹑样品溶液1.0mL和0.1% H2O21.0 mL，加纯水补充体积至10.0 mL，37℃水浴90min，测定510nm吸光度[11]。以纯水代替H2O2溶液作为空白对照，同法处理。按公式（3）计算羟自由基（·OH）清除率。

式中：A样品为加入样品（抗氧化剂）及H2O2的吸光度值；A空白以纯水代替样品及H2O2的吸光度值；A未损为样品及H2O2均用纯水代替的吸光度值。

3 结果与分析

3.1 核桃蛋白及多肽对DPPH·清除能力

核桃蛋白及多肽对DPPH·清除率结果见图1。

图1 核桃蛋白及多肽对DPPH·清除率Fig.1 The DPPH radical scavenging capacity of walnut protein and polypeptide

由图1可知，核桃蛋白、核桃多肽和GSH对DPPH·清除率在一定范围内皆随浓度增加而升高，并存在一定的剂量-效应关系。当浓度为1.00mg/mL时，核桃多肽对DPPH·清除率是核桃蛋白的4倍，随着浓度的增加，其优势逐渐减弱；当浓度达到5.00mg/mL时，两者DPPH·清除率差异不大，接近75.00%，达到GSH的80%，可见核桃蛋白及多肽对DPPH·均较强的清除能力。

3.2 核桃蛋白及多肽对O2-·清除能力

核桃蛋白及多肽对O2-·清除率结果见图2。

图2 核桃蛋白及多肽对O2-·清除率Fig.2 The superoxide anion radical scavenging capacity of walnut protein and polypeptide

3.3 核桃蛋白及多肽的总还原能力

核桃蛋白及多肽的总还原能力结果见图3。

图3 核桃蛋白及多肽总还原能力Fig.3 The deoxidization capacity of walnut protein and polypeptide

由图3可知，核桃蛋白﹑核桃多肽总还原能力明显低于对照品GSH，但相同浓度的核桃多肽总还原能力几乎是核桃蛋白的2倍。

3.4 核桃蛋白及多肽对·OH清除能力

核桃蛋白及多肽对·OH清除率结果见图4。

图4 核桃蛋白及多肽对·OH清除率Fig.4 The hydroxyl radical scavenging capacity of walnut protein and polypeptide

由图4可知，在一定范围内三者对·OH清除能力存在一定剂量效应。浓度相同时，三者对·OH清除能力的顺序为：GSH>核桃多肽>核桃蛋白。当浓度为2.00mg/mL时，核桃多肽对·OH清除率约为核桃蛋白的6倍；当浓度为10.00mg/mL时，核桃多肽对·OH清除率约为核桃蛋白的4倍。因此，在2.00mg/mL～ 10.00mg/mL范围内，核桃多肽对·OH清除率明显优于核桃蛋白，且达到对照品GSH的50%以上。

4 结论与讨论

GSH是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸构成的含巯基三肽，可与烷自由基、过氧自由基、半醌自由基等作用，是体内非常重要的自由基清除剂[12]。据文献报道，人体内存在大量的自由基，虽然体内同时存在抗氧化剂和抗氧化酶，但当机体代谢异常时，就会打破自由基产生和清除的动态平衡，导致氧化应激[13]。心脏病、糖尿病[14]、动脉粥样硬化等疾病的产生与体内自由基含量的增加有关[15]。例如，过量的自由基破坏线粒体结构，诱导细胞凋亡，减少胰岛素合成与分泌，诱发糖尿病[14]；动脉粥样硬化是由炎性氧化应激和氧化酶活性增高导致[16]；而衰老也是自由基对细胞成分的有害攻击[17]。因此，考察核桃蛋白及多肽的抗氧化活性对于核桃的深度研究具有重要意义。

本试验以GSH作对照，利用4种体外抗氧化模型考察核桃蛋白和多肽抗氧化活性。结果表明，核桃蛋白、核桃多肽皆具有一定的抗氧化活性，且核桃多肽的活性显著高于核桃蛋白。就DPPH·清除能力和O2-·清除能力而言，核桃多肽的效果达到对照品GSH的80%以上，对·OH清除率亦达到GSH的50%以上。综上，核桃多肽具有明显的抗氧化活性，有望通过后期深入研究为其综合开发利用提供参考。

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Studies on the Antioxidant Activity of Walnut Protein and Polypeptide by Multi-index

LI Li1，2，RUAN Jin-lan1，2，QIAN Wei-liang1，ZHOU Han-li1，2，WANG Ya-yun1，2，WU Na1，2，LIU Yang1，2，*

（1.Engineering Technology Research Center of Biological Peptide Antidiabetics of Hubei Province，Synergy Innovation Center of Biological Peptide Antidiabetics of Hubei Province，School of Life Science，Wuchang University of Technology，Wuhan 430223，Hubei，China；2.School of Chemical Engineering and Pharmacy，Wuhan Institute of Technology，Wuhan 430073，Hubei，China）

To evaluate the antioxidant activity of walnut protein and polypeptide.Compared with GSH，the antioxidant activity of walnut protein and polypeptide was measured by using the DPPH radical scavenging capacity，superoxide anion radical scavenging capacity，deoxidization capacity，and hydroxyl radical scavenging capacity.Within the experimental concentration，the antioxidant activity of walnut protein and polypeptide showed a dose-dependent manner.Moreover，the walnut polypeptide significantly exhibited DPPH radical scavenging capacity and superoxide anion radical scavenging capacity，with more than 80% of GSH，and the hydroxyl radical scavenging ability of polypeptide reached more than 50%of GSH.Walnut protein and polypeptide were deter mined to have obvious antioxidant activity，and the antioxidant activity of walnut polypeptide was more significant.

walnut protein；walnut polypeptide；antioxidant activity；glutathione

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.03.001

2016-04-07

湖北省自然科学基金资助项目（2013CFB482）；湖北省大学生创新训练项目（201312310012）；武昌理工学院校级项目（2015X04）作者简介：李丽（1992—），女（汉），硕士研究生，研究方向：生物多肽糖尿病药物研究。

*通信作者：刘阳，副教授，研究方向：天然产物分离分析及活性研究。