含动物药成分的活力胶囊质量标准的建立＊

孙 旭，马晓昱，马 群，高 媛，刘云云，陈 瑶

含动物药成分的活力胶囊质量标准的建立＊

孙 旭，马晓昱，马 群，高 媛，刘云云，陈 瑶＊

目的 建立含动物药成分的活力胶囊的质量标准。方法采用显微镜法对土鳖虫体壁碎片、刚毛、肌纤维等成分进行观察鉴别；薄层色谱法对活力胶囊处方中的动物药土鳖虫、穿山甲进行定性鉴别，并用凝血酶滴定法对水蛭素抗凝血酶的活性进行测定。结果土鳖虫显微镜鉴别特征明显，易于区分；土鳖虫、穿山甲的供试品薄层色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；水蛭素抗凝血酶活性均值为94.2 U/g。结论该方法结果准确、重现性好，总体较为满意，可作为该胶囊制剂的质量控制方法。

活力胶囊；质量标准；薄层色谱法；水蛭素

活力胶囊是海军青岛第二疗养院研制的纯中药制剂，含有动物药成分，如水蛭、穿山甲（自然死亡）、土鳖虫等，具有活血化瘀，通经镇痛的作用，用于肝硬化，心脑血管疾病等病的治疗，取得良好的治疗效果。国内对含动物类成分的药品和制剂的质量控制相对薄弱。为提高含有动物药制剂的质量标准，更好地控制质量，本研究在参考相关文献的基础上，建立活力胶囊的定性定量检测方法。笔者采用显微镜法对体壁碎片、刚毛、肌纤维进行观察鉴别，采用TLC法对处方中土鳖虫、穿山甲等进行定性鉴别，采用凝血酶滴定法测定水蛭中的水蛭素含量，为活力胶囊的质量标准提供更加完备、简便可行、准确可靠的定性定量检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料薄层层析硅胶G、（青岛海洋化工集团）；ZF-6型三用紫外分析仪；METTLER AE240电子天平；AS-B超声波清洗仪；HG-B电热恒温干燥箱；HH-8电热恒温水浴锅；奥林巴斯CX-31显微镜（广州明美数码成像系统）。标准品凝血酶（批号106A065，1000U/支，索来宝生物科技有限公司）、标准试剂牛纤维蛋白原（批号522A027，索来宝生物科技有限公司）、对照药材土鳖虫 （批号121533-201303，中国食品药品检定所）、穿山甲 （批号121027-201004，中国食品药品检定所）；活力胶囊样品（批号20130401、20130902、20140101）；其他试剂均为分析纯。

1.2 方 法

1.2.1土鳖虫显微鉴别［1-3］照显微鉴别法试验，取本品内容物适量，过四号筛，挑取少许置载玻片上，滴加水合氯醛试液，盖上载玻片。

1.2.2土鳖虫的鉴别［1-3］（1）供试品溶液的制备。取本品内容物4 g，加甲醇30 ml超声处理20 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇5 ml使溶解，即得。（2）对照药材溶液的制备。取土鳖虫对照药材，按“（1）”项下方法制成对照药材溶液。（3）阴性对照品溶液的制备。取不含土鳖虫的阴性样品，按“（1）”项下方法制成阴性对照品溶液。（4）薄层色谱鉴别。按薄层色谱法试验，吸取上述3种溶液各5 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-二氯甲烷-丙酮（5∶5∶0.5）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯（365 nm）下检视。

1.2.3穿山甲的鉴别［1，4］（1）供试品溶液的制备。取本品内容物4 g，加三氯甲烷80 ml，加热回流4 h，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加三氯甲烷1 ml使溶解，即得。（2）对照药材溶液的制备。取穿山甲对照药材，按“（1）”项下方法制成对照药材溶液。（3）阴性对照品溶液的制备。取不含穿山甲的阴性样品，按“（1）”项下方法制成阴性对照品溶液。（4）薄层色谱鉴别。按薄层色谱法试验，吸取上述3种溶液各5 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-丙酮（20∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以醋酐-硫酸（9∶1）混合溶液，在80℃加热数分钟，分别置日光和紫外灯（365 nm）下检视。

1.2.4水蛭素（抗凝血酶）的含量测定［1，5］（1）供试品溶液的制备。取本品内容物约1 g，精密称定，精密加入0.9%氯化钠溶液5 ml，充分搅拌，浸提30 min，并时时振摇，3 000 r/min离心10min，为供试品溶液。（2）牛纤维蛋白原溶液的制备。精密取牛纤维蛋白原的凝固物适量，加三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液，制成含量为0.5%的溶液（临用前配制）。（3）凝血酶溶液的制备。取凝血酶1000 U，制备成1000 U/ml的贮备液，再取适量加0.9%氯化钠溶液制备成40 U/ml的凝血酶溶液。（4）测定方法。精密量取供试品溶液50 μl，置试管（8 mm×38 mm）中，加入含0.5%（牛）纤维蛋白原溶液200 μl，摇匀，置水浴中（37±0.5）℃温浸5 min，滴加每1 ml中含40 U的凝血酶溶液（每1 min滴加1次，每次1 μl，边滴加边轻轻摇匀）至凝固，记录消耗凝血酶溶液的体积，按下式计算：U=C1V1/C2V2；式中U为每1g含凝血酶活性单位（U/g），C1为凝血酶溶液的浓度（μ/ml），C2为供试品溶液的浓度（g/ml），V1为消耗凝血酶溶液的体积（μl），V2为供试品溶液的加入量（μl）。

2 结果

2.1 土鳖虫显微鉴别置显微镜下观察，体壁碎片深棕色或黄色，表面有不规则纹理，其上着生短粗或细长刚毛，常可见刚毛脱落后的圆形毛窝；刚毛棕色或黄色，先端锐尖或钝圆，有的具纵直纹理。横纹肌纤维无色或淡黄色，常碎断，细密横纹。结果见图1。

图1 土鳖虫显微鉴别

2.2 土鳖虫的鉴别结果供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照品溶液则无此斑点；喷以香草醛硫酸试液，在105℃加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照品溶液则无此斑点。结果见图2。

图2 土鳖虫的鉴别

2.3 穿山甲的鉴别结果供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照品溶液则无此斑点；置紫外灯（365 nm）下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照品溶液则无此斑点。色谱详见图3。

图3 穿山甲的鉴别

2.4 水蛭素的含量测定水蛭素（抗凝血酶）的含量测定结果见表1。

表1 活力胶囊抗凝血酶活性

3 讨论

显微鉴别方面，刚毛、体壁碎片和肌纤维不仅具有生物学稳定性，而且具有明显的显微特征，土鳖虫为《中国药典》收载品种，因此采用此方法进行显微鉴别，该方法简便、可靠，可为活力胶囊中土鳖虫的鉴别提供依据。薄层鉴别方面，本研究按照《中国药典》方法对本制剂中含有的土鳖虫和穿山甲进行定性鉴别，结果表明，该方法简便、可行、快捷，专属性强，可用于活力胶囊的质量控制。水蛭素测定方面，水蛭的主要药用功效为破血通经，消积散症，消肿解毒，其主要活性成分为水蛭素，是从水蛭中提取的抗凝血蛋白质，具有强烈的抗凝血作用，是含水蛭药的主要评价指标［5］。

本文采用 《中国药典》2015年版一部方法对水蛭素的含量进行测定，发现活力胶囊抗凝血酶的活性符合每1 g含凝血酶活性水蛭不低于16.0 U，而且远远高于这个值。鉴于本制剂处方中还含有穿山甲、土鳖虫等动物药，也具有活血散结的作用，其可能会与水蛭有协同作用，作用机制有待进一步研究。本实验中所得抗凝血酶活性结果的相对标准偏差较大，原因是在滴加凝血酶时，每次滴加体积已至最小刻度单位μl，每1 min滴加1次，1 μl/次，没有办法继续缩小，在消耗体积相对小的情况下，相对标准偏差就会相对大。

［1］国家药典委员会编.中华人民共和国药典2015年版：一部［S］．北京：中国医药科技出版社，2015：19，83，268．

［2］薛纯盛，赵佳丽，宋珍鹏，等.活血通脉胶囊含量测定方法的探讨［J］.中国药品标准，2012，13（3）：206-209.

［3］绍 燕，辛俐华，孙金霞，等.鳖甲煎丸中3种昆虫药刚毛及体壁碎片的显微鉴别研究［J］.中成药，2012，34（12）：2358-2361.

［4］康阿龙，张苏蘅，张 娴.乳癖克胶囊质量标准的研究［J］.解放军药学学报，2012，27（1）：47-49.

［5］范尚坦，李金兰，张 勇，等.水蛭中水蛭素含量测定的改进［J］.中国中药杂志，2008，33（19）：2277-2279.

［2016－05－13收稿，2016－06－10修回］

［本文编辑：刘一洋］

Establishing the quality standard of Huoli Capsules containing animal components

SUN Xü①，MA Xiao-yu，MA Qun，et al.①Institute for Drug and Instrument Control of Jinan Military Region，Jinan，Shandong 250022，China

ObjectiveTo establish the quality standard for Huoli Capsules containing animal components.MethodsIntegumentary cells，Seta，myofiber were identified by microscopic identification；Groung beeltle，Pangolin in this prescription were identified by TLC；and the content of antithrombin activation was determined by titration．ResultsThe microscopic identification can be distinguished clearly and easily；the spotsin the TLC of Groungbeeltle，Pangolin were in the same color with those in the chromatograms of control articles；Detected mean value of antithrombinis activation was 94.2 U/g.ConclusionThe method used in this study is easy，accurate and reproducible．Therefore，it could be used effectively for the quality control of this capsule preparation．

Huoli Capsules；Quality standard；TLC；Hirudin

R918

A

10.14172/j.issn1671-4008.2017.02.022

军队医疗机构制剂标准提高科研专项课题（14ZJZ01-2）

250022山东济南，济南军区联勤部药品仪器检验所（孙旭，马晓昱，高媛，刘云云，陈瑶）；266071山东青岛，海军青岛第二疗养院（马群）

陈瑶，Email：chenyao1975@163.com