肿瘤细胞“温伯格效应”及其相关检测的研究进展*

李懿皞，吴炯，郭玮，潘柏申

(复旦大学附属中山医院检验科，上海 200032)

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肿瘤细胞“温伯格效应”及其相关检测的研究进展*

李懿皞，吴炯，郭玮，潘柏申

(复旦大学附属中山医院检验科，上海 200032)

自从Otto Warburg于1920年观察到肿瘤细胞倾向于糖酵解的代谢改变现象以来，肿瘤的代谢重组一直是人们研究的热点。2011年，肿瘤细胞的代谢重组(即“温伯格效应”)被认为是肿瘤十大特征之一，相关检测技术和理论也在不断发展。该文归纳肿瘤细胞的“温伯格效应”及其相关的检测方法的研究进展，旨在为今后该领域的研究提供依据。

肿瘤；温伯格效应；检测技术；研究进展

2000年，美国学者Hanahan和Weinberg总结并提出了恶性肿瘤的6大特点：对凋亡机制的逃避、生长抑制基因的回避、组织浸润和转移、持续的生长信号、无限增殖的潜能和长久诱导血管生成[1]；2011年，两位学者在之前的基础上又总结了恶性肿瘤存在的新的4个特点，即逃避免疫破坏、促肿瘤炎症、基因组的不稳定和突变以及能量代谢的重组[2]。这些肿瘤特征的发现和归纳近年来也受到了学界的普遍承认和接纳，针对肿瘤特征的研究和相关的治疗也广泛开展。本文拟对恶性肿瘤细胞的温伯格效应的研究进展和检测方法进行归纳和总结，旨在为今后相关研究的开展提供理论依据。

1 温伯格效应

肿瘤疾病的本质是一种细胞增殖的失控，而肿瘤细胞也会调节自身的代谢以适应快速增殖分化的需要。正常细胞在有氧条件下，葡萄糖首先在胞浆中经过糖酵解转化为丙酮酸，随后通过线粒体的氧化磷酸化产生CO2和大量的ATP；而在无氧条件下则更多地会发生糖酵解过程，只有少量的丙酮酸会在线粒体中发生氧化磷酸化的过程。20世纪20年代，Otto Warburg发现了肿瘤细胞能量代谢的特异性改变：即便在有氧的条件下，肿瘤细胞的葡萄糖代谢情况也会更加倾向于糖酵解，从而发生“有氧糖酵解”现象，即现在所说的“温伯格效应”(Warburg-effect)[3]。

从肿瘤细胞生长需要大量的ATP这一角度来看，倾向于发生有氧糖酵解这种相比线粒体氧化磷酸化产能效率低18倍的代谢方式看似有违常理；但从另一个角度来说，这种“需氧糖酵解”现象产生的同时，我们也能看到肿瘤细胞对葡萄糖摄取量的提升，这种提升可以满足肿瘤细胞生物合成对碳源的需求。有学者指出，这种大量增加葡萄糖摄取进入细胞质中的情况部分是通过上调葡萄糖转运蛋白1(GLUT-1)的表达产生的[4]。后续的研究证实，某些癌基因(如ras、myc基因等)的激活或抑癌基因(如TP53等)的失活[5]，均与这种“有氧糖酵解”的肿瘤代谢重组产生相关。以上基因的激活或失活赋予肿瘤细胞增殖能力提升、逃避生长抑制和细胞凋亡的特点。此外，由于肿瘤组织的内部常存在缺氧环境，这种对于糖酵解的依赖作用往往还会增加。例如，肿瘤细胞对缺氧条件的反馈调节作用可上调葡萄糖转运蛋白和糖酵解途径中关键酶的表达水平[6]。这些蛋白质和酶表达情况的改变也为实验室开展相关的检测提供了理论的依据。而ras等的癌基因和细胞所处的缺氧环境也会提高缺氧诱导因子(HIF)-1α和HIF-2α的转录水平来上调肿瘤细胞糖酵解的水平[7]。

虽然肿瘤细胞的“需氧糖酵解”过程产生ATP的量远不如通过线粒体氧化磷酸化的过程，但有学者提出了一个设想：糖酵解水平的提升使得葡萄糖代谢的中间产物能更多地进入到其他生物合成通路中，生成大量的核苷酸和氨基酸，促进新细胞合成所需的生物大分子及细胞器的合成[8]，同时还能规避氧化磷酸化产生的活性氧导致的细胞凋亡。此外，分化期的胚性细胞中观察到的类似“温伯格效应”的代谢过程也暗示了大规模的生物合成对于细胞增殖的必要性。

在某些肿瘤细胞中常存在处于不同能量代谢状态的细胞亚群。一种是由葡萄糖依赖性的(即“温

伯格效应”型)细胞，它们可摄取葡萄糖发生糖酵解反应，释放出乳酸作为代谢产物；另一群细胞则会摄取其周围细胞产生的乳酸进行部分的三羧酸循环来产生能量[9]。这两群细胞在功能上相互依赖共生：缺氧的细胞利用葡萄糖产能，代谢产物为乳酸；另一群富氧的细胞则利用这些乳酸来更好地产生能量。尽管这种共生关系在肿瘤组织内的普遍性尚有待于进一步的研究证实，但这种对于乳酸释放和利用的生理现象在肌肉组织中普遍存在。最近的研究发现，肿瘤组织糖酵解产生的乳酸会导致肿瘤微环境发生改变，进而影响肿瘤组织周围免疫细胞的作用，达到免疫逃逸的目的[10]。

2 温伯格效应的发生机制

肿瘤细胞代谢重组的分子机制相当复杂。有学者提出肿瘤的温伯格效应的发生机制可能与糖酵解代谢酶的表达异常、肿瘤细胞线粒体功能受损、抑癌基因失活和原癌基因的激活、信号转导通路紊乱及肿瘤细胞微环境改变等有关[11]。另有学者提出，肿瘤的产生有氧糖酵解现象的原因可能有3点：其一，相较于肿瘤细胞供能，其代谢的优先级向增加细胞分子数量的方向转换；其二，可能是肿瘤细胞通过减少线粒体氧化磷酸化产生的活性氧来规避细胞凋亡的一种方式；其三，可能是其为了肿瘤中处于有氧环境部分的肿瘤细胞能更快更好地产生ATP，处于无氧或微含氧环境下的部分肿瘤细胞则转而通过糖酵解的方式来产生足够的乳酸来供其消耗[12]，这一点最好的证据是有学者观察到了肿瘤组织中分别存在着“温伯格效应”型细胞“非温伯格效应”型细胞的存在[13]。

2.1线粒体功能缺陷 肿瘤细胞的线粒体往往较小，还常常伴有线粒体嵴的缺失、ATP合成酶b-F1亚基的缺少等现象，学者们也常常用线粒体的功能缺陷来解释“温伯格效应”的发生。随着肿瘤的发生和发展，线粒体DNA(mtDNA)发生突变的可能性也会随之上升，与此同时，有些mtDNA的突变同样也会促进肿瘤的进展[14]。研究显示，mtDNA的突变和许多肿瘤(如甲状腺癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌等)均存在着相关性，mtDNA的突变在其编码区及非编码区能被检测到[15]。由于mtDNA的突变存在着阈值效应，往往需要一个细胞中的突变量达到60%以上时才会对其线粒体功能产生影响，因此，也有学者认为，mtDNA的突变仅仅是肿瘤细胞氧化应激和细胞分化的结果[16]。

2.2缺氧诱导因子(HIF) “温伯格效应”的一个主要分子机制在于HIF的活化。HIF是一种通常由于缺氧应激而被激活的转录因子，但它也会因为癌基因、炎症、代谢和氧化应激而激活。HIF-1是一种由基础稳定的β亚基和不稳定的α亚基组成的异源二聚体，但这类转录因子在正常氧含量的条件下会由于氧气依赖的脯氨酰羟化酶和泛素连接酶的连续反应而降解。HIF-1能通过上调葡萄糖转运体1(GLUT-1)、己糖激酶(HK，包括HK-I和HK-Ⅱ)、乳酸脱氢酶A(LDH-A)以及乳酸排出酶单羧酸转运体4(MCT4)来促进葡萄糖向丙酮酸和乳酸的转化作用[17]，通过丙酮酸脱氢酶(PDH)途径，HIF能减少丙酮酸向乙酰辅酶A的转化，从而降低氧化磷酸化反应的进程；此外，HIF-2可以通过c-Myc降低肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性[18]。

另一方面，许多学者认为HIF-1α的表达能使肿瘤细胞糖酵解通路的相关酶、蛋白质、mRNA的表达水平存在异常，如磷酸果糖激酶(PFK)[19]、HK-Ⅱ、PKM2、LDH-A、GLUT-1[20-21]等。而这种改变常常和相关代谢酶/蛋白质的一种亚型有关，最典型的改变是丙酮酸激酶M2型(PKM2)。PKM2是一种表达于胚胎干细胞等类型干细胞中的一种表型，其在肿瘤细胞中的表达量多升高，而这也伴随着正常细胞中的PKM1亚型表达量的降低[22]。

2.3癌基因和抑癌基因异常 除了线粒体损伤和HIF的影响，许多的癌基因、抑癌基因的异常表达都可能引起葡萄糖糖摄取和糖酵解水平的改变，包括Akt、Ras、Src、p53等[23]。此外，这类基因表达的改变，还能调节肿瘤细胞信号转导通路中其他基因的表达，从而更进一步地影响肿瘤细胞的代谢和肿瘤的发生与发展。

总之，温伯格效应的产生与癌基因的表达改变、线粒体功能和数量的降低以及HIF的表达有着密切的关系，而它的最终表现则是糖酵解相关酶和蛋白质的表达量的提升。

3 温伯格效应检测技术

一般说来，增生活跃的肿瘤细胞都会调节其能量代谢以满足其细胞不断生长巨大的能量和生物合成的需求。而相关的检验技术的发展则能让我们更好地理解肿瘤的这一特征，同时也为临床的诊断提供新的可能性。

3.1葡萄糖摄取 目前的研究多采用不会被代谢的葡萄糖类似物如荧光脱氧葡萄糖(FDG)、2-脱氧-D-葡萄糖(2DG)、3-O-甲基葡萄糖(3MG)等研究肿瘤细胞中葡萄糖的摄取效率[24]。在细胞培养中，荧光标记的葡萄糖类似物[如2-(N-7-硝基-2,1,3-苯并恶二唑-4-氨基)-2-脱氧-D-葡萄糖(2-NBDG)等]的摄取可以通过流式细胞仪或是荧光显微镜进行检测，这需要细胞培养、收集技术以及流式细胞术的联合应用[25]。目前根据肿瘤对2-脱氧-2-(18F)-氟-D-葡萄糖(18FDG)摄取的PET-CT技术已被广泛地用于肿瘤患者肿瘤发生及其转移的诊断中。

3.2糖酵解限速酶的活性 酶活性的检测主要是将几种重要的关键酶和NAD+/NADH+依赖的可见的或吸光度上变化的酶促反应相结合的过程。此外，有学者指出，通过实时定量逆转录PCR(qRT-PCR)[26]、western blot技术[27]和免疫组化技术[28]分别可以在核酸、蛋白质和组织中糖酵解相关的酶类的表达和分布情况进行检测，但这些技术仍主要应用于临床科研中，其临床价值仍待验证。

3.3代谢组学和无机代谢产物 代谢产物的定量分析可以通过采用碳-13(13C)或氚(3H)标记葡萄糖，并采用质谱技术(MS)或核磁共振技术(NMR)检测下游代谢产物的活性来检测细胞的糖酵解活性。碳-13(13C)可以用来置换葡萄糖分子中6个碳原子中的任意一个位置的碳；氚(3H)标记葡萄糖中的氚(3H)元素最终会形成H2O，带有氚(3H)元素的H2O则会通过烯醇化酶的转换作用被释放到培养基中，从而可以通过液相闪光计数来定量检测[29]。

3.4氧气的消耗 氧气消耗率(OCR)是线粒体呼吸作用检测的一个常规的检测项目，而且细胞内和细胞外OCR都可以用于检测。一般来说，胞内的氧气消耗水平能更准确地反应一个细胞的代谢活跃程度；胞外的氧气消耗则常用以Clark电极为代表的极谱法或光学探针进行检测[30]，而细胞外流量分析仪则可以实时检测多种细胞代谢参数，如OCR、细胞外酸化率(ECAR)等。目前专门的代谢研究实验室中，Seahorse细胞代谢检测仪比较常用，这也为细胞代谢的研究提供了一个途径。

3.5细胞外酸化情况 伴随葡萄糖摄取增高的糖酵解增加会导致额外的乳酸释放到细胞外环境中。采用商业化的检测试剂通过比色或荧光反应可定量检测细胞培养液中的乳酸含量。糖酵解的活性可通过丙酮酸向乳酸的转换来反应，而用细胞外流量分析仪可以检测和确定ECAR的范围[29]，通过添加葡萄糖和糖酵解/氧化磷酸化的抑制剂也能反应糖酵解能力和糖酵解储存。

3.6谷胱甘肽(GSH) GSH是一种能够防止自由基和过氧化物酶损伤细胞的组织抗氧化剂。氧化应激水平的提升会生成氧化型谷胱甘肽(GSSG)，最后导致GSSG和GSH比例的改变，而对氧化应激的敏感性的提升则与肿瘤的发展有关[31]。肿瘤细胞中GSH分子途径的改变可导致化疗药物的耐药性，增加肿瘤的生存性。在卵巢癌、乳腺癌、头颈癌和肺癌等肿瘤组织中的GSH水平较正常组织中常常呈增加的趋势，而在肝和脑部肿瘤中则有着相反的情况[32]。GSH和GSSG的水平一般能通过分光光度法快速而准确地检测，这对于临床研究的开展具有一定的意义。

总之，由于温伯格效应的本质是肿瘤细胞的代谢改变，其检测主要也是围绕着代谢的原料(葡萄糖等)、关键酶和产物(H2O和CO2等)来展开，目前临床上唯一得以广泛应用的技术主要是围绕影像学展开的PET-CT技术，其他相关的技术依旧存在方法学建立和难以标准化等问题，因此仍需我们后续更为深入的研究和探索。

4 小结及展望

目前，肿瘤细胞的温伯格效应作为肿瘤的一大特征已经被广为接受，但其机制仍需进一步的解明；在检测的角度来看，目前临床上除了PET-CT以外，基本没有其他利用肿瘤细胞温伯格效应来对肿瘤进行检测的方法，其原因可能和标准化的困难等有关。近期的研究显示，肿瘤细胞产生的乳酸对浸润于组织中的免疫细胞的杀伤作用有抑制的作用；虽然这其中的机理仍待我们探索，但是对发展肿瘤的靶向治疗，尤其是免疫治疗提供了一个重要线索。因此，解明肿瘤细胞的温伯格效应，对肿瘤的诊断、治疗都有着重大的意义。

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2017-07-21)

(本文编辑：许晓蒙)

10.13602/j.cnki.jcls.2017.11.02

国家自然基金面上项目(81572064)；上海市卫生计生系统重要薄弱学科建设项目(2015ZB0201)。

李懿皞，1995年生，男，大学本科，研究方向：肿瘤学。

潘柏申，研究员，E-mail：pan.baishen@zs-hospital.sh.cn。

R-1;R730.4

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