HDL对3T3-L1细胞葡萄糖转运的影响及其机制研究

付 虹，戎有和

HDL对3T3-L1细胞葡萄糖转运的影响及其机制研究

付 虹1，戎有和2*

目的 探讨HDL对3T3-L1细胞葡萄糖转运的影响及其机制。方法 通过对3T3-L1成纤维细胞的分化，培养符合实验要求的3T3-L1脂肪细胞。通过葡萄糖消耗实验和3H标记的2-脱氧葡萄糖的摄取实验，研究HDL对葡萄糖转运的影响，应用RT-PCR和Western blot探讨其机制。结果 HDL可以促进3T3-L1脂肪细胞对葡萄糖的转运和摄取。3T3-L1脂肪细胞对葡萄糖的转运和摄取过程中，蛋白在RNA转录水平上没有增加，而是发生了AKT、AMPK蛋白的磷酸化。结论 HDL促进3T3-L1脂肪细胞对葡萄糖的摄取是通过AKT和AMPK两种途径来实现的。

高密度脂蛋白；3T3-L1细胞；葡萄糖转运；胰岛素抵抗

0 引言

胰岛素抵抗是一个慢性非特异性炎症持续过程[1-2]，是糖尿病、血脂异常和肥胖症等代谢性疾病共同的生理病理基础，主要表现为外周组织尤其是肌肉、脂肪组织对葡萄糖的利用障碍[3-4]。高密度脂蛋白(High density lipoprotein，HDL)降低是很多代谢性疾病的共同特征，有研究证实，在脂肪组织和细胞中，HDL通过调节胆固醇的转运来发挥其抗炎作用[5]。1984年，有学者提出，升高HDL能够使低HDL的患者受益。之后的相关研究表明，直接给予HDL的效果最明显。本文采用3T3-L1细胞作为工具细胞，研究外源性给予HDL后对糖代谢的影响并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 材料 3T3-L1小鼠成纤维细胞购自上海中科院研究所细胞库。

1.2 试剂和药品 HDL购自美国Calbiochem公司；3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX)、地塞米松、胰岛素购自Sigma公司；葡萄糖测定试剂盒购自上海荣盛生物技术有限公司；Triton-X100购自上海翔升生物科技有限公司；DMEM高糖培养基购自GIBCO公司；胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)购自美国Clark公司；IR-β抗体、IRS-1抗体、磷酸化IRS-1抗体、AKT抗体、磷酸化AKT抗体、AMPK抗体、磷酸化AMPK抗体、β-actin抗体购自美国 Cell Signaling Technology公司；磷酸化IR-β抗体购自英国Abcam公司；多克隆GLUT4抗体购自美国Chemicon公司。辣根过氧化物酶标记二抗由Bioward公司提供；PCR引物由上海Invitrigen公司合成，Trizol、M-MLV反转录酶购自美国Invitrigen公司，其余PT-PCR所需试剂购自美国Promega公司；PCR Marker由广东东盛生物科技有限公司提供；琼脂糖由Bioscience chemie公司提供；其他常用试剂均为国产分析纯。

1.3 主要仪器 Mastercycler gradient 5331 PCR仪、生物分光光度计，德国Eppendorf公司产品；水平电泳仪、电泳槽、垂直电泳仪、电泳槽，美国Bio-Rad公司产品；JS-380C全自动数码凝胶成像分析仪，上海培清科技有限公司产品；Biofuge fresco低温离心机，德国Heraeus公司产品；WH-2微型旋涡混合仪，上海沪西分析仪器厂产品；EC-5型恒温水浴仪，德国Julabo公司产品。

2 实验方法

2.1 3T3-L1细胞的培养和分化 3T3-L1成纤维细胞为梭形，胞浆内无脂滴，培养基为高糖DMEM (10%胎牛血清，1%链霉素-青霉素的双抗)置37 ℃、5% CO2培养箱培养。每2天更换培养基1次，至细胞单层融合达80%以上时，可进行传代培养。用胰蛋白酶1 mL消化细胞1 min，待细胞变圆并从瓶壁上脱落，立即加入含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基终止消化。调节细胞浓度为2×105个/mL，接种于24孔板或6孔板中培养。待细胞长满融合后2 d，加入含1 mg/L胰岛素、0.5 mmol/L IBMX、0.25 mmol/L地塞米松的高糖DMEM (含10%胎牛血清)进行分化。2 d后，给予含10 mg/L胰岛素的高糖DMEM (含10%胎牛血清)继续培养2 d。此后给予高糖DMEM(含10%胎牛血清)继续培养。至第8天，95%以上3T3-L1细胞形态变成近圆形，胞浆内充满脂滴，分化成为成熟的脂肪细胞。整个分化过程需要8～12 d。

2.2 分化后3T3-L1细胞的形态和鉴别 分化后的3T3-L1细胞在光镜下可见圆形脂滴，油红O染色可以确定分化后的3T3-L1细胞是脂肪细胞。

采用油红O染色法进行脂肪细胞的鉴定，具体方法如下：①将爬有已分化好的脂肪细胞玻片从培养板中取出，用PBS充分洗涤；②10%福尔马林固定10 min；③PBS漂洗3次；④油红O染液中浸20 min；⑤PBS漂洗4次；⑥60%乙醇漂洗；三蒸水漂洗后，晾干，置于光镜下观察，脂肪细胞中的脂滴呈亮红色。

2.3 实验分组 采用传代10代以内的分化后的3T3-L1脂肪细胞。分为4组：①正常组(Normal)；②高密度脂蛋白组(HDL组)；③胰岛素组(Insulin组)；④胰岛素+高密度脂蛋白组(Insulin+HDL组)。HDL给药剂量通过做浓度梯度后确定。给药时间参照文献。

2.4 给药 实验采用分化后较好的3T3-L1脂肪细胞。细胞给药前，加入无血清的低糖DMEM培养基，于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育24 h，使细胞生长同步进入休止期。然后按照分组要求给药。

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2.5 葡萄糖消耗量 饥饿24 h后，四组细胞分别给予不同浓度的HDL (0、1、10、100 μg/mL)孵育1 h，取细胞培养液上清，测定其吸光度值；1%Triton-X100裂解细胞，用Bradford法测定蛋白浓度。由此确定HDL的最佳浓度是100 μg/mL。同时，结果显示，HDL可以增加分化后3T3-L1细胞对葡萄糖的消耗，且差异有统计学意义。

2.63H标记的2-脱氧葡萄糖的摄取实验 将分化后的3T3-L1脂肪细胞分组给药，在含0.1% BSA的低糖DMEM中培养24 h，取上清待测。用含0.1% BSA的KRH缓冲液继续培养1 h后，分别加入HDL和胰岛素作用30 min，然后加入3H标记的2-脱氧葡萄糖0.5 μCi/mL培养30 min，处理后的细胞用KRH洗涤2次，取上清液用液体闪烁仪记录放射强度(Counts per minute，CPM)。

2.7 RT-PCR给药处理后的细胞 PBS洗涤3次后，加入1 mL Trizol (Invitrogen)，反复吹打，将其转移至EP管中。按照RNA提取说明书提取总RNA。逆转录过程：采用Invitrogen公司M-MLV逆转录酶，并按照试剂盒说明书进行总cDNA的合成。PCR反应采用Taq DNA聚合酶(Promega)。

在Genbank中查找到小鼠的葡萄糖转运体1 (GLUT1)的mRNA序列[基因收录号(NM_011400)]，该基因全长2 573 bp；小鼠的葡萄糖转运体4 (GLUT4)的mRNA序列[基因收录号(NM_009204)]，该基因全长2 822 bp；小鼠的胰岛素受体(IR)的mRNA序列[基因收录号(NM_010568)]，该基因全长9 357 bp；小鼠胰岛素受体底物-1(IRS-1)在Genbank中的mRNA序列[基因收录号(NM_010570)]，该基因全长9 163 bp。交于公司合成引物供实验使用。引物序列如下：

GLUT1ForwardATGGAACCACCGCTACReverseTAAGGATGCCAACGACGLUT4ForwardCCGAAAGAGTCTAAAGCGReverseGAGCCACGGTCATCAAGIRForwardTCCGCCGCTCCTATReverseCAGAGTTTCGGGTTGTAATIRSForwardGGATCGTCAATAGCGTAAReverseGCTTGGCACAATGTAGAA

按图1筛选结果。以上引物的最佳退火温度分别为55.7、56.6、52.5、51.5 ℃。

RT-PCR反应产物半定量分析：配制2%的琼脂糖凝胶，用溴化乙锭染色，然后取5 μL PCR产物上样，100 V恒压电泳，凝胶成像系统拍照观察，计算目的条带和内参GAPDH的灰度比值。

2.8 Western blot 给药后各组分别用胰酶消化细胞，收集，用RIPA裂解细胞，提取细胞的总蛋白并用Bradford法测定其各组浓度。之后按以下步骤检测p-IR-β蛋白、p-IRS-1蛋白、p-AKT蛋白和p-AMPK蛋白的表达。①灌胶、上样：其中分离胶10%，浓缩胶5%；②SDS-PAGE电泳：先恒压85 V、20 min，待样品全部进入分离胶后改为恒压110 V、2 h；③转膜：PVDF 膜，转膜条件为4 ℃，恒压110 V，2 h；④封闭：用5%脱脂奶粉封闭液，室温封闭2 h，封闭液用TBST (50 mM Tris-HCl，pH 7.5，150 mM NaCl，0.05% Tween 20)配制；⑤一抗结合：TBST 稀释一抗(p-IR-β抗体滴度为1∶1 000，p-IRS-1抗体滴度1∶1 000，p-AKT抗体滴度为1∶1 000，p-AMPK抗体滴度为1∶1 000，β-actin 抗体滴度为1∶200)，4 ℃过夜;⑥洗膜：TBST 漂洗3次，5 min/次；⑦二抗结合：TBST 稀释二抗，室温孵育2 h；⑧洗膜：TBST 漂洗4次，10 min/次；⑨显色：使用化学发光显色试剂进行显色，用成像系统仪器观察拍照。

3 实验结果

3.1 已分化3T3-L1细胞图像 按照实验方法中的步骤对3T3-L1成纤维细胞进行分化，8～12 d后,在倒置显微镜下放大100倍，观察已分化好的3T3-L1脂肪细胞，结果见图2。倒置显微镜下观察可见，3T3-L1前脂肪细胞已经完全分化为成熟的脂肪细胞，细胞形态变成圆形或类圆形，体积变大，胞浆中可见大量透亮的、大小不等的脂滴。多数小脂滴融合成大脂滴，并将胞核推向一侧，形成典型的“戒环”样结构。

图2 已分化3T3-L1细胞图像(100×)

3.2 油红O染色的分化后3T3-L1细胞图像 按照实验方法中的步骤，对已分化的3T3-L1脂肪细胞进行油红O染色，确定细胞内含有大量的脂滴是符合实验要求的脂肪细胞。由图3可见，油红O染色法对成熟的3T3-L1脂肪细胞进行特异性染色，胞浆中可见大量的染成橙红色的脂肪颗粒。

图3 油红O染色的分化后3T3-L1细胞图像(100×)

3.3 葡萄糖试剂盒测定葡萄糖消耗 给予不同浓度HDL (100、10、1 μg/mL)，用葡萄糖试剂盒测定葡萄糖消耗量，提示100 μg/mL HDL才能明显促进脂肪细胞对葡萄糖的消耗，其浓度过小时，与Normal组比较差异无统计学意义(P>0.05)。因此，在后续的实验中，HDL的剂量均为100 μg/mL。结果见图4。

由图5可见，HDL (100 μg/mL)组和Insulin (100 nmol/L)促进葡萄糖消耗的能力相当，而 HDL (100 μg/mL)+Insulin (100 nmol/L)组促进葡萄糖消耗的能力强于HDL组或Insulin组。提示HDL和Insulin可能存在协同作用。

图4 各组葡萄糖消耗量比较(n>3)

图5 各组葡萄糖消耗量比较(n>3)

3.43H标记的2-脱氧葡萄糖显示的葡萄糖摄取 HDL (100 μg/mL)能够促进3T3-L1脂肪细胞对放射性标记的2-脱氧葡萄糖的摄取，与阳性对照组Insulin (100 nmol/L)摄取能力相当，同时，HDL (100 μg/mL)+Insulin (100 nmol/L)组可能通过协同作用促进葡萄糖的摄取。见图6。

图6 各组细胞葡萄糖摄取量比较(n>3)

3.5 PT-PCR检测和葡萄糖转运相关的2个蛋白(GLUT1、GLUT4)及IR-β、IRS-1在RNA水平上的表达 实验均采用5～10代分化状态良好的3T3-L1细胞，饥饿24 h后，分为空白组和给药组HDL (100 μg/mL)，孵育4 h，收集细胞，提取RNA。通过RT-PCR法测定给予HDL 4 h后GLUT1、GLUT4、IR-β、IRS-1各蛋白的转录水平。结果显示，HDL组和Normal组比较，脂肪细胞内与葡萄糖转运相关的转运体和蛋白在RNA水平上没有增加。见图7。

图7 两组GLUT1、GLUT4、IR-β、IRS-1蛋白mRNA含量比较(n>3)

3.6 Western blot法检测胰岛素信号途径中蛋白(IR-β、IRS-1)及其下游AKT蛋白的磷酸化情况 给药后10 min收集各实验组细胞。各转运体和蛋白在RNA转录水平没有增加，说明蛋白水平不会增加。因此，笔者检测与葡萄糖转运相关蛋白的磷酸化情况。结果显示，HDL组、Insulin组和HDL+Insulin组各蛋白的磷酸化程度均明显超过Normal组。见图8～图10。

图8 各组IR-β蛋白磷酸化变化(n>3)

3.7 Western blot法检测AMPK蛋白磷酸化情况 HDL组、Insulin组和HDL+Insulin组均出现了AMPK的磷酸化过程，与Normal组比较差异有统计学意义。见图11。

图9 各组IRS-1蛋白磷酸化变化(n>3)

图10 各组AKT蛋白磷酸化变化(n>3)

图11 各组AMPK蛋白磷酸化变化(n>3)

4 讨论

胰岛素可以促进葡萄糖摄取，因此，本研究采用胰岛素作为阳性对照组。结果显示，HDL可以浓度依赖性地促进葡萄糖摄取，且HDL浓度为100 μg/mL时对葡萄糖的消耗最大，与10 μg/mL和1 μg/mL比较，差异有统计学意义。因此，后续实验中HDL的给药浓度为100 μg/mL。分组实验显示，HDL组、Insulin组、HDL+Insulin组对葡萄糖的消耗量均明显高于空白组。随后，3H-2-脱氧葡萄糖摄取实验也得到相同的结论。同时，HDL+Insulin组对葡萄糖的消耗和摄取都明显高于HDL组或Insulin组，说明HDL与Insulin可能存在协同作用，与文献报道[6]一致。

RT-PCR研究显示，给予HDL后，转运葡萄糖的2个主要转运体(GLUT1、GLUT4)和经典的胰岛素信号途径中IR-β、IRS-1的RNA转录并没有增加，说明HDL促进葡萄糖消耗和摄取并不是因为转运蛋白生成的增加所致，推测其原因可能是蛋白磷酸化。Western blot结果显示，在HDL促进葡萄糖转运的过程中，IR-β、IRS-1、AKT、AMPK蛋白均发生磷酸化，与对照组相比有显著性差异，表明HDL通过引起蛋白磷酸化通路，而实现葡萄糖的转运过程。

胰岛素信号途径是目前公认的胰岛素促进葡萄糖摄取的信号途径。胰岛素与IR-а结合，激活β亚基的酪氨酸活性。IR-β亚基酪氨酸激酶磷酸化IRS-1蛋白，介导PI3K的P85亚基、生长因子受体结合蛋白-2(Grb-2)、Syp、SHC、Crk、Nck等一系列蛋白[7-9]。而IRS-1通过PI3K途径来调节AKT蛋白[6,8]。AKT作为胰岛素信号途径中的下游分子，参与调节葡萄糖稳态、蛋白合成、细胞存活等生物过程。另外，AKT还影响了一系列的生物学过程，包括代谢、细胞周期的调节和凋亡[10-11]。胰岛素激活的AKT可以刺激脂肪细胞中葡萄糖的摄取[12-14]。此外，普遍的观点认为，胰岛素可通过胰岛素信号途径、AMPK信号途径促进葡萄糖的摄取。有报道，在外周脂肪组织或C2C12肌细胞中，胰岛素刺激可以激活PI3K/AKT和AMPK途径[12,15]，促进葡萄糖的转运。本研究中，HDL组、Insulin组、HDL+Insulin组IR-β酪氨酸1146位点、IRS-1丝氨酸307位点、AKT的丝氨酸473位点均出现明显磷酸化，与Normal组相比有显著差异。因此，我们认为，胰岛素信号途径参与了HDL对葡萄糖转运的促进过程。

AMPK广泛存在于哺乳动物的骨骼肌、肝脏、胰腺和脂肪组织中，一直被认为是调控葡萄糖和脂质代谢的能量感受器[16-17]。AMPK是一个由α、β、γ 3个亚基构成的异三聚体，α亚基起催化作用，β、γ亚基在维持三聚体稳定性和作用底物特异性方面起重要作用[18-19]。AMPK-α亚基的苏氨酸172位点磷酸化是其激活的必要条件。有研究表明，AMPK在骨骼肌的能量代谢调节中起重要作用[20]。有报道，机械刺激和电刺激均可以增加肌肉细胞内的AMPK的活性，增加葡萄糖的摄取[21-25]。AMPK可能通过胰岛素信号途径来增加肌肉组织和小鼠的C2C12肌细胞葡萄糖的摄取[26-27]。在3T3-L1细胞中，激活AMPK也可以促进葡萄糖的转运[28]。在内皮细胞，给予外源性HDL诱导的NOS和NO合成也是通过激活AMPK途径来实现的[29-30]。近年来，AMPK作为潜在的缓解组织胰岛素抵抗的靶点，引起了人们的重视。有报道，AMPK激活在诱导脂肪因子分泌中起重要的调节作用[31-32]。本研究显示，在3T3-L1细胞中，给予HDL后，AMPK明显磷酸化而被激活。结果表明，HDL通过胰岛素信号途径和AMPK信号途径促进葡萄糖的转运。

本实验在文献支持的基础上进行研究，通过3T3-L1细胞证实HDL促进葡萄糖转运和摄取，既阐明了现象，又探索了部分机制。同时，我们还有进行进一步研究的空间和需求，有待于在不同的细胞中证实此结论，并探索更多的作用机制来阐明这一现象。

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Effect and mechanism of HDL on glucose transport in 3T3-L1 cells

FU Hong1,RONG You-he2*

(1.Affiliated Hospital of Nanjing University of Traditional Chinese Medicine,Nanjing 210029,China;2.Nanjing University of Traditional Chinese Medicine,Nanjing 210029,China)

Objective To investigate the effect and mechanism of HDL on glucose transport in 3T3-L1 cells.Methods 3T3-L1 cells were cultured and induced to differentiation and maturation.The effect of HDL on glucose transport was studied by glucose consumption test and [3H]-2-deoxyglucose glucose uptake experiment.The mechanism of the effect was explored by Western blot and RT-PCR experiment.Results HDL can promote glucose transport and uptake in 3T3-L1 cells.In this process,the protein did not increase at the RNA transcriptional level,but the phosphorylation of AKT and AMPK proteins appeared.Conclusion HDL stimulates glucose uptake in 3T3-L1 cells,involving PI3K/AKT and AMPK signaling pathways.

HDL;3T3-L1 cell;Glucose transport;Insulin resistance

2016-07-26

1.南京中医药大学附属医院，南京 210029；2.南京中医药大学，南京 210029

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201702002