不同提取方法的紫地榆提取物对常驻口腔细菌的研究*

杨晓珍，蓝海

（大理大学 药学与化学学院，云南 大理 671000）

不同提取方法的紫地榆提取物对常驻口腔细菌的研究*

杨晓珍，蓝海

（大理大学 药学与化学学院，云南 大理 671000）

D O I：10.3969/j.i s s n.1005-8982.2017.03.004

目的研究不同方法提取紫地榆正丁醇部分和乙酸乙酯部分对变形链球菌、黏性放线菌和血链球菌生长及产酸的影响。方法首先分别测定不同方法提取的紫地榆正丁醇部分和乙酸乙酯部分对变形链球菌、黏性放线菌及血链球菌的最低抑菌浓度（M IC）和最低杀菌浓度（M BC），再以低于M IC的4个浓度配制含药的胰酶解酪蛋白-植物蛋白胨-酵母提取物液体培养基，测定紫地榆正丁醇部分和乙酸乙酯部分对3种常驻口腔细菌产酸的影响。结果热提的紫地榆正丁醇部分对变形链球菌、黏性放线菌及血链球菌的M IC分别为3.0、3.0和6.0 g/L，M BC分别为6.0、6.0和12.0 g/L。热提的紫地榆乙酸乙酯部分对变形链球菌、黏性放线菌及血链球菌的M IC均为6.0g/L，M BC均为12.0g/L。冷提的紫地榆正丁醇部分对变形链球菌、黏性放线菌及血链球菌的M IC均为6.0 g/L，M BC均为12.0 g/L。冷提的紫地榆乙酸乙酯部分对变形链球菌、黏性放线菌及血链球菌的M IC均为6.0 g/L，M BC均为12.0 g/L。一定浓度的紫地榆正丁醇部分和乙酸乙酯部分对3种常驻口腔细菌的产酸有一定的抑制作用，但提取方法的不同对其抑制产酸的能力差异无统计学意义。结论紫地榆正丁醇部分和乙酸乙酯部分能有效抑制口腔致龋菌的生长和产酸，可能是一种潜在的天然防龋药物。

紫地榆；变形链球菌；粘性放线菌；血链球菌；产酸

紫地榆是牻牛儿苗科老鹳草属植物的根，在云南的白族、彝族等少数民族地区长期用作厌食症的治疗，具有消炎、止痢和收敛的功效。有研究证明，紫地榆有良好的抗体外常见胃肠道细菌的作用，并能降低被痢疾志贺菌感染的小鼠死亡率[1-3]。此外，紫地榆不同溶剂提取物有抑制釉质脱矿和促进再矿化的作用，且其水提物能有效抑制口腔致龋菌变形链球菌和血链球菌的生长和产酸[4-12]。本实验旨在比较研究紫地榆不同提取方法的正丁醇部分和乙酸乙酯部分对3种常驻口腔细菌产酸的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

紫地榆购于大理药材市场，由大理大学药学与化学院鉴定为紫地榆的根。变形链球菌（st rept ococcus m ut ans，ATCC25175）、血链球菌（act i nom yces vi scosus，ATCC9246）、黏性放线菌（st rept ococcus sangui s，ATCC27044）均购自广东微生物菌种保藏中心。胰酶解酪蛋白-植物蛋白胨-酵母提取物（t rypt i casephyt one-yeast ext ract m edi um，TPY）固体及液体培养基，0.5和 0.1 m ol/L氢氧化钠，0.05%洗必泰（chl orhexi di ne acet at e，CA），0.5 m ol/L磷酸盐缓冲溶液（phosphat e buf f er sal i ne，PBS）、蔗糖、无水乙醇、葡萄糖、石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇均为分析纯。

1.2 紫地榆粗提物的提取

1.2.1 冷提 95%乙醇常温浸泡粉碎的原药材24 h，抽滤，把滤液旋转蒸发成浸膏后加适量蒸馏水溶解，分别用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，所得石油醚和三氯甲烷部分多为色素且提取物含量较少故舍去，其余部分冷冻干燥后得粉末备用。

1.2.1 热提 95%乙醇50℃回流提取，提取6次，2 h/次，抽滤，把滤液旋转蒸发成浸膏后加适量蒸馏水溶解，分别用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，所得石油醚和三氯甲烷部分多为色素且提取物含量较少故舍去，其余部分冷冻干燥后得粉末备用。

1.3 菌液的制备

将3株冻干菌株复苏48h后接种于TPY液体培养基中厌氧条件下（37℃、80%氮气N2，20%二氧化碳CO2）培养18 h。经生化鉴定及涂片检查为纯培养后，3 000 r/m i n离心15 m i n，弃上清液，菌细胞用无菌生理盐水洗涤。再次离心，重复离心洗菌3次。分别将洗净的3种菌细胞用无菌生理盐水稀释，用0.5麦氏单位标准比浊管调菌悬液的浓度约5×107CFU/m l。

1.4 最低抑菌浓度和最低杀菌浓度的测定

将紫地榆各萃取物按2倍稀释法分别溶于含1%葡萄糖的TPY液体培养基中，使其终浓度分别为48.000、24.000、12.000、6.000、3.000、1.500、0.750 和0.375 g/L。将菌悬液与含药液的培养基按1∶10（V/ V）比例，加入96孔板后置37℃、80%N2，20%CO2下厌氧培养48 h。肉眼观察是否有菌生长，以无菌生长的紫地榆萃取物浓度为其最低抑菌浓度（m i ni m um i nhi bi t ory concent rat i on，M IC）。选择大于M IC浓度的各孔，分别取20μl涂布于TPY固体培养基上，在相同条件下培养48 h，肉眼观察菌落数少于5～6个的最低萃取物浓度为最低杀菌浓度（m i ni m um bact erici dal concent rat i on，M BC），实验重复3次。

1.5 紫地榆提取物对3种常驻口腔细菌产酸能力影响的测定

根据紫地榆各萃取部分对上述3种常驻口腔细菌的M IC测定结果，将含1%葡萄糖和紫地榆萃取物的TPY液体培养基配成M IC以下浓度梯度的4个实验组，另设1个含0.05%洗必泰的阳性对照组、1个不含药物的阴性对照组，共6组，每组设3个平行管，实验重复2次。调定初始pH值为7.4并按菌悬液∶TPY液体培养基为1∶10（V/V）的比例接种细菌后置于37℃、80%N2，20%CO2厌氧条件下培养48h。用pH酸度计测定培养物上清液的pH值并计算其变化值△pH，△pH=初始pH值-终末pH值[13-14]。

1.6 统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组比较用单因素方差分析（anal ysi s of vari ance，ANOV），若方差齐，则两两比较用Dunnet t-t检验，检验水准α=0.05，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 紫地榆各提取物部分对3种常驻口腔细菌生长的影响

紫地榆各提取物对3种常驻口腔细菌均有生长抑制和杀菌作用，热提的紫地榆正丁醇部分的抑菌与杀菌效果最好，而用不同方法提取的紫地榆乙酸乙酯部分抑菌与杀菌效果相近。见表1。

表1 紫地榆各提取部分对3种口腔常驻细菌的影响（g/L）

2.2 紫地榆各提取部分对3种常驻口腔细菌产酸的影响

各组与阴性对照组比较，差异有统计学意义（F= 280.121，P=0.000），热提的紫地榆正丁醇提取物浓度（C≥1.500 g/L）对血链球菌产酸的抑制效果与洗必泰的相近（P=0.664）；热提的紫地榆乙酸乙酯部分，较高质量浓度组（C≥3.000 g/L）与阳性对照组抑制口腔细菌产酸的效果相近（P＞0.05）。冷提的紫地榆正丁醇部分浓度（C≥3.000 g/L）对变形链球菌产酸的抑制效果与洗必泰的相近（P=0.012）；冷提的紫地榆乙酸乙酯浓度（C≥3.000 g/L）对变形链球菌产酸的抑制效果与洗必泰的相近（P=0.149）。见表2。

表2 紫地榆各提取物部分对3种常驻口腔细菌产酸的影响 （n=6，±s）

表2 紫地榆各提取物部分对3种常驻口腔细菌产酸的影响 （n=6，±s）

注：1）与阴性对照组比较，P＜0.05；2）与阳性对照组比较，P＜0.05

组别变形链球菌ΔpH黏性放线菌ΔpH血链球菌ΔpH热提正丁醇1.500 g/L0.983±0.05851）2）0.9733±0.06291）2）0.5500±0.04511）0.750 g/L 1.1200±0.03741）2） 1.0650±0.05681）2） 0.6533±0.07041）0.375 g/L 1.9083±0.04751）2） 1.3600±0.07571）2） 0.9650±0.06211）2）0.187 g/L 1.9800±0.06631）2） 1.4917±0.07031）2） 1.0700±0.06271）2）阳性对照组 0.7583±0.0319 0.6633±0.0453 0.5650±0.03641）2）阴性对照组 3.0717±0.0343 2.8483±0.0414 1.6667±0.0632乙酸乙酯3.000 g/L0.6767±0.05341）0.8833±0.06291）2）0.6800±0.06401）2）1.500 g/L 0.9933±0.07481）2） 0.9967±0.05651）2） 0.7917±0.02971）2）0.750 g/L 1.3883±0.08531）2） 1.3567±0.11161）2） 1.1600±0.06301）2）0.375 g/L 1.7183±0.05961）2） 1.5267±0.05821）2） 1.3983±0.06411）2）阳性对照组 0.7517±0.0430 0.6900±0.0513 0.5633±0.0382阴性对照组 3.0683±0.0393 2.8467±0.0591 1.6567±0.0415冷提正丁醇3.000 g/L0.6533±0.07651）0.6383±0.04951）0.6333±0.05911）1.500 g/L 0.9667±0.05191）2） 0.9150±0.06781）2） 0.7900±0.05131）2）0.750 g/L 1.3483±0.07511）2） 1.1900±0.04431）2） 0.9683±0.06721）2）0.375 g/L 2.0700±0.06561）2） 1.3483±0.04301）2） 1.2767±0.05471）2）阳性对照组 0.7650±0.0496 0.6433±0.0464 0.5833±0.0534阴性对照组 3.0533±0.0471 2.8400±0.0497 1.6583±0.0471乙酸乙酯3.000 g/L0.8567±0.07481）0.8933±0.03501）2）0.7800±0.05571）2）1.500 g/L 1.1017±0.05241）2） 1.0533±0.04921）2） 0.8567±0.03541）2）0.750 g/L 1.4517±0.07901）2） 1.3750±0.05851）2） 1.2083±0.06361）2）0.375 g/L 1.8533±0.07591）2） 1.5167±0.04991）2） 1.5150±0.06211）2）阳性对照组 0.7750±0.0427 0.6567±0.03941）2） 0.5250±0.0535阴性对照组 3.0683±0.0393 2.8650±0.0435 1.6683±0.0334

3 讨论

龋病是口腔常见病、多发病，其实质是牙菌斑内细菌酵解碳水化合物产生有机酸，引起牙体无机物脱矿，有机质崩解，最终导致龋损形成的慢性进行性疾病。本实验选用的变形链球菌、血液链球菌及黏性放线菌是口腔常驻细菌。这3种细菌都能发酵多种碳水化合物产酸，使菌斑pH值降到＜5，因此其生长、产酸代谢与龋病的发生密切相关[15]。本实验结果显示，紫地榆正丁醇和乙酸乙酯提取物对口腔3种常见菌均有显著的产酸抑制作用，但提取方法的不同对其抑制产酸的能力差异无统计学意义。

在对口腔细菌产酸影响的实验中，为排除药物本身因抑制菌细胞生长而产生的对产酸的抑制表现，采用在M IC浓度以下的4个浓度梯度。而实验中所用的洗必泰是一种广谱抗生素，临床上主要用于饮水消毒，角膜溃疡、菌痢、牙周病、狐臭、冻伤、阴道炎及宫颈糜烂的治疗，能减少牙周病和龋病的发生[16]。在临床上通常首选0.05%洗必泰漱口水治疗各种致龋菌引起的各型口腔疾病，故用含0.05%洗必泰作为阳性对照组。有研究显示，紫地榆乙酸乙酯部分、正丁醇萃取部位及水部分对致龋菌的生长、产酸有一定的抑制作用，但其水部分效果相对较差[17-18]。

综上所述，一定浓度的紫地榆正丁醇与乙酸乙酯萃取物可抑制3种常驻口腔细菌的生长及产酸，其中热提的紫地榆正丁醇部分的抑菌与杀菌效果最好，用不同方法提取的紫地榆乙酸乙酯部分抑菌与杀菌效果相近，抑酸作用方面，差异无统计学意义。其原因可能是提取方法的改变只是引起其有效成分含量的改变，并未导致其有效成分数量的改变；热提法提取紫地榆会使其各浸膏的提取率分别有所提高。天然药物紫地榆对常驻口腔细菌的生长及产酸有一定的影响，可考虑开发成牙膏、漱口水等应用形式，但同时天然药物活性成分比较复杂，其具体有效成分目前尚不明确，故有待进一步研究。

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（童颖丹 编辑）

Effect ofGeranium Strictipesextracts extracted by different methods on acid production of three strains of oral bacteria*

Xiao-zhen Yang,Hai Lan
(College of Pharmacy and Chemistry,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China)

ObjectiveTo inquire into the effect of N-butyl alcohol and ethyl acetate extracts ofGeranium Strictipesextracted by different methods on growth and acid production ofStreptococcus mutans,Streptococcus sanguisandActinomyces viscosus.MethodsFirstly,minimum bacteriostatic concentration (MIC)and minimum bactericidal concentration(MBC)of N-butyl alcohol and ethyl acetate extracts ofGeranium Strictipesextracted by different methods onStreptococcus mutans,Streptococcus sanguisandActinomyces viscosuswere respectively determined and then the effect of theseGeranium Strictipesextracts on the acid production was determined.ResultsThe MIC of N-butyl alcohol extract ofGeranium Strictipesextracted reflux onStreptococcus mutans,Streptococcus sanguisandActinomyces viscosuswere 3.0,3.0 and 6.0 g/L respectively,while the MBC were 6.0,6.0 and 12.0 g/L respectively.The MIC of ethyl acetate extract ofGeranium Strictipesextracted reflux on the three bacteria strains were all 6.0 g/L,and the MBC were all 12.0 g/L.The MIC of N-butyl alcohol extract ofGeranium Strictipesextracted maceration on the three bacteria strains were all 6.0 g/L,the MBC were all 12.0 g/L.The MIC of ethyl acetate extract ofGeranium Strictipesextracted maceration on the three bacteria strains were all 6.0 g/L,the MBC were all 12.0 g/L.A certain concentration of N-butyl alcohol and ethyl acetate extracts ofGeranium Strictipescould inhibit acid production of the three bacteria strains, but there was no significant difference in the inhibition of acid production by different extraction methods.ConclusionsN-butyl alcohol and ethyl acetate extracts ofGeranium Strictipescan effectively inhibit the growth and acid production of oral bacteria,may be effective anti-caries agents.

Geranium Strictipes;Streptococcus mutans;Streptococcus sanguis;Actinomyces viscosus;acid production

1005-8982（2017）03-0018-04

R 781.1

A

2016-03-25

国家自然科学基金（No：81260512）；云南省大理学院应用开发研究基金（No：Kyyy201102）

蓝海，E-m ai l：l anhai 8696@126.com；Tel：13769225179