一例仔猪病毒性腹泻的PCR检测

李小伦

（山东省博兴县畜牧兽医局 山东滨州 256500）

猪病毒性腹泻是猪群各种腹泻中造成危害最为严重的一种急性、高度接触性肠道传染病，可导致仔猪高死亡率以及耐过猪生长缓慢、饲料报酬降低、养殖成本增加等[1]，是危害仔猪健康的主要传染病之一。2017年4月，山东博兴某猪场发生腹泻疫情，主要表现为7日龄仔猪突然发病，体温升高，食欲减退，咳嗽，呕吐，严重腹泻，脱水，全身淋巴结肿大，肠壁变薄，呈透明状，肠道中夹杂黄色稀粪及未消化凝乳块。通过临床特征初步判断为仔猪病毒性腹泻，为进一步确定致病原，采集病死猪病料样品并进行了猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪轮状病毒（RV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）、猪圆环病毒 2型（PCV-2）、猪瘟病毒（CSFV）和伪狂犬病毒（PRV）7种可导致仔猪腹泻的致病原的实验室PCR检测。

1 材料和方法

1.1 主要试剂与试剂盒

DL 2,000 DNA Marker、One Step RT-PCR Kit、Premix Taq均购自宝生物（大连）工程有限公司；病毒基因组RNA提取试剂盒、病毒基因组DNA提取试剂盒均购自北京百泰克生物科技有限公司。

1.2 病料样品的采集与处理

无菌采集病死猪的肠道组织，将其加入5倍体积灭菌生理盐水中，组织捣碎机捣碎后，经“-20℃～室温”反复冻融三次后，12,000rpm离心10min，吸取上清液即为处理后的临床病料样品。

1.3 病毒基因组的提取

按照病毒基因组RNA提取试剂盒的操作步骤提取临床病料样品的RNA，按照病毒基因组DNA提取试剂盒的操作步骤提取临床病料样品的DNA。

1.4 RT-PCR/PCR检测

根据于新友等[2]建立的PEDV、RV、TGEV一步法三重RT-PCR检测方法，李圣等[3]建立的PRRSV、CSFV一步法双重RT-PCR检测方法，郭晓秋等[4]建立的PRV、PCV-2双重PCR检测方法分别合成PEDV、RV、TGEV、PRRSV、CSFV、PRV、PCV-2 特异性检测引物（引物信息如表1所示）。分别利用PEDV、RV、TGEV一步法三重RT-PCR检测方法，PRRSV、CSFV一步法双重RT-PCR检测方法对病料样品的RNA进行检测，利用PRV、PCV-2双重PCR检测方法对病料样品的DNA进行检测。各种RT-PCR/PCR扩增体系与扩增程序如表1所示。

1.5 扩增结果的检测

RT-PCR/PCR扩增结束后，取10μL扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，根据电泳中特异性扩增片段的大小判定检测结果。

2 结果与分析

如图 1 所示，PEDV、RV、TGEV 一步法三重RT-PCR检测方法对病料样品扩增出1条约450bp特异性条带，与预期PEDV扩增片段的大小相符；PRRSV、CSFV一步法双重RT-PCR检测方法对病料样品扩增出1条约350bp特异性条带，与预期PRRSV扩增片段的大小相符；PRV、PCV-2双重PCR检测方法对病料样品扩增出1条189bp的特异性条带，与预期PCV-2扩增片段的大小相符。该结果表明此次仔猪发生的腹泻疫情主要由PEDV、PRRSV、PCV-2的混合感染所致。

3 讨论

近年来，随着我国养猪业的规模化快速发展，仔猪病毒性腹泻的发病率明显增加，尤其是2010年以来我国猪场从南到北，从东到西陆续暴发PEDV变异毒株感染疫情，霍翠梅等[1]对济宁地区21个规模化猪场58份腹泻仔猪样品进行PEDV、TGEV、RV、CSFV、PCV-2、PRRSV 和 PRV 的检测，阳性感染率依次为 75.0%、0、13.6%、40.9%、36.4%和77.3%，PEDV与 CSFV、PRRSV、PCV-2混合感染率分别为45.6%、31.8%、59.1%，表明PEDV成为目前仔猪病毒性腹泻的主要致病原，且与CSFV、PRRSV、PCV-2的混合感染率增高，混合感染情况较严重。多种致病原的混合感染给疫病的诊断与防治增加了难度，PCR方法因其操作简单、检测快速、敏感性高，且能够扩增致病原的特异性核苷酸序列，为疫病混合感染的确诊提供了有效的检测技术手段。本病例通过PCR方法确诊致病原为PEDV、PRRSV、PCV-2混合感染，为发病猪场找到了致病原，也为其它病例的诊断提供了参考与借鉴，临床中发现病毒性腹泻时，应重点考虑是否存在混合感染，做到及时、准确的确诊致病原。■

表1 7种病毒RT-PCR/PCR扩增信息汇总表

图1 RT-PCR/PCR扩增结果

[1] 霍翠梅,郝晴晴,吕玉星.2015年-2016年济宁地区导致猪腹泻的病毒性病原调查报告[J].当代畜牧,2016(5)：38.

[2] 于新友,李天芝,沈志强.一步法多重RT-PCR检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪A群轮状病毒方法的建立和应用[J].养猪,2016(2)：105-107.

[3] 李圣,郑欢莉,李红炳,等.一步法RT-PCR同时检测CSFV和PRRSV方法的建立及应用[J].动物医学进展,2011,32(6)：40-44.

[4] 郭晓秋,曲哲会,刘涛.猪伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型多重PCR检测方法的建立与初步应用 [J].中国兽医杂志,2015,51(10)：34-37.