地衣芽孢杆菌BL5产孢发酵条件优化

张莉力,许云贺,肖海蒂,王淋枫,黄 涛,陈文莹,2,*

(1.锦州医科大学食品科学与工程学院,辽宁锦州 121001;2.遵义医学院公共卫生学院,贵州遵义 563000)

张莉力1,许云贺1,肖海蒂1,王淋枫1,黄 涛1,陈文莹1,2,*

(1.锦州医科大学食品科学与工程学院,辽宁锦州 121001;2.遵义医学院公共卫生学院,贵州遵义 563000)

地衣芽孢杆菌作为一个益生菌在食品或饲料工业中都具有广泛的应用前景。本实验以芽孢数和芽孢率为指标,经Plackett-Burman设计实验、最陡爬坡实验和响应面实验,得到最佳发酵条件为:K+浓度为0.002 mol/L、Mg2+浓度为1 g/L、接种量5%、种子菌龄12 h,发酵温度30 ℃、发酵时间为36 h。对确定的最佳发酵条件进行验证实验,结果得到地衣芽孢杆菌BL-5的产芽孢率为94.67%,芽孢数为3.32×109CFU/mL。

地衣芽孢杆菌BL-5,芽孢率,芽孢数,响应面法

地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)是一类益生菌,属于G+好氧菌[1]。地衣芽孢杆菌因有着良好的适应能力和能产生丰富的酶系,使其长期应用于生产食品工业用的酶制剂。Roy等[2]从印度东北部阿萨姆的土壤样品中分离到一个嗜碱菌菌株。该菌株能够在极碱性pH(12.5)条件下生长并产生α-淀粉酶。Rehman等[3]分离的地衣芽孢杆菌KIBGE IB-21具有果胶酶活性。Gurung等[4]通过来自地衣芽孢杆菌DSM 13的UDP葡糖基转移酶YjiC在体外成功合成了芹菜素糖苷。

此外,地衣芽孢杆菌是一种理想的饲料添加剂,能够提高肠屏障功能和抑制致病细菌粘附于肠壁,能够提高牲畜的免疫力和抗病力,提高饲料的利用率,增加牲畜和家禽的生产能力[5-6]。Zhang等[7]研究表明膳食地衣芽孢杆菌水平从0上升到1×107CFU/g,白细胞数量、补体活性以及血清总蛋白、球蛋白含量全部显著升高。Gobi等[8]研究表明105CFU/mL地衣芽孢杆菌Dahb1能够通过增强亚洲鲶鱼的生长、免疫及抗氧化来抵抗副溶血性弧菌Dahv2感染。Lei等[5]研究表明饲喂含地衣芽孢杆菌(0.01%和 0.03%)的饲料能够增加鸡蛋产量和质量,并且存在剂量依赖关系。地衣芽孢杆菌发挥其作用主要通过降低应激响应、上调生长激素和增进肠道健康来实现。Liu等[9]研究表明膳食补充地衣芽孢杆菌能够显著增加肉鸡体重,并显著改善3～6周和0～6周饲养期的饲料转化率。此外,补充地衣芽孢杆菌也导致蛋白质和游离氨基酸含量的增加,并降低鸡胸肉条脂肪含量(p<0.05)。因此地衣芽孢杆菌可作为在肉鸡生长促进和肉质增强剂。

因此本文在前期单因素实验的基础上,通过响应面实验对地衣芽孢杆菌BL-5芽孢数及芽孢率的影响因素进行优化,为提高地衣芽孢杆菌BL-5的益生效果提供基础数据支持,为地衣芽孢杆菌BL-5在食品或饲料工业中的应用奠定基础。

表1 芽孢率及芽孢数PB设计实验结果Table 1 The results of the rate and number of spores in the experiment of Plackett-Burman design

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

地衣芽孢杆菌BL-5 锦州医科大学食品微生物实验室保存。

牛肉膏、蛋白胨、酵母膏 均为北京奥博星生物技术有限责任公司。

SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台 苏州净化设备有限公司;YXQ-LS型立式压力蒸汽灭菌器 上海博讯实业有限公司;UV754PC紫外分光光度计 上海佑科仪表有限公司;DHP-9082型恒温培养箱 金坛市鑫鑫实验仪器厂;DHP-9052型pH计 上海一恒科技有限公司;M4-AL204电子分析天平 兰州中西仪器有限公司;HZQ-F200振荡培养箱 北京东联哈尔仪器制造有限公司;数码生物显微镜 奥林巴斯(中国)有限公司;微量移液器 百得实验室仪器;DK-98-1型水浴锅 天津泰斯特仪器公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种活化方法 将冻存于-80 ℃超低温冰箱中的地衣芽孢杆菌BL-5以2%(体积/体积)接种量接入5 mL种子培养基(牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、水1 L、pH7.0)进行活化,37 ℃下150 r/min摇床培养24 h,传代培养3次。至活力上升后,接种于斜面培养基(营养琼脂)上,用于实验过程中种子菌的制备。

1.2.2 产芽孢菌的筛选 将活化后的保存于斜面上的菌株挑取少许划线于促芽孢培养基(葡萄糖1.0 g、蛋白胨1.0 g、硫酸铵0.2 g、酵母膏0.7 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、磷酸氢二钾1.0 g、琼脂20.0 g(固体培养基时),水1 L,pH7.2)平皿上,30 ℃培养24 h后挑选独立且大菌落到装有25 mL无菌生理盐水中,振荡均匀后置100 ℃水浴锅中水浴10 min,再涂布于促进芽孢生长的培养基的平板上进行培养,反复多次。最后挑取平板上大的单菌落转接到促进芽孢生长培养基的试管斜面上,30 ℃下培养24 h后,转置于4 ℃冰箱冷藏室保存备用。

1.2.3 芽孢测定方法 芽孢数(b):将培养后的菌液在致死温度(75 ℃)下处理15 min后,迅速冷却后采用稀释梯度平皿计数法统计活菌数;总菌数(a):将培养后的菌液直接进行稀释梯度平皿计数法统计活菌数[10]。

1.2.4 实验设计

1.2.4.1 Plackett-Burman设计(PB设计)筛选主要影响因素 在前期对地衣芽孢杆菌BL-5的生长条件优化(固定:蔗糖29.85 g/L、硫酸铵10.00 g/L、酵母膏3.00 g/L、pH8.0、转速150 r/min)[11]基础及产孢单因素实验的基础上,对除了致死温度和种子培养基(牛肉膏蛋白胨培养基)2个因素以外的6个因素(发酵时间、发酵温度、接种量、种子菌龄、K+浓度和Mg2+)进行Plackett-Burman设计[12]。运用Minitab软件将其6种因素进行两水平实验设计,每组实验同时进行3个平行实验,取均值确立主要影响因素。

1.2.4.2 最陡爬坡实验确定转折点 在Plackett-Burman设计实验确定的三个主要影响因素的结果基础上,根据三个因素的影响的正负效应,设计出6个实验,每组实验同时进行3个平行实验,取均值分析出其中作为转折点的一个实验条件。

1.2.4.3 响应面分析法确定最大响应值 在最陡爬坡的基础上,确定了一个最高点,然后运用Minitab软件对三种因素采用Box-Behnken法进行优化,每组实验同时进行3个平行实验[13-14]。

1.2.5 统计分析 运用SPSS Statistics17.0软件进行单因素方差分析,其中两两比较采用了SNK方法;Plackett-Burman设计、部分析因设计和响应面Box-Behnken法采用Minitab16.0软件进行方差分析[15-16]。

2 结果与分析

2.1 PB设计筛选主要影响因素

首先,由表1可知,第8个实验的芽孢率最佳,能达到93.90%,但以芽孢数为指标比较时,第10个实验的芽孢数最佳(13.2×108CFU/mL),且芽孢率能达到82.00%。再由图1和图2的芽孢率和芽孢数的标准化效应分析可知,芽孢率有发酵时间、K+浓度和Mg2+浓度具有显著差异,但以芽孢数作为指标统计分析时,6个因素均无显著差异。此外,从图1可看出,发酵时间、K+浓度和Mg2+浓度的显著性影响次序为:发酵时间>K+浓度>Mg2+浓度。以芽孢数为指标时,如图2所示,并无显著差异的影响因素。

表2 芽孢率和芽孢数的最陡爬坡实验设计及结果Table 2 The steepest ascent experimental design and results of the rate and number of spores

注:不同字母之间表示存在显著差异(p<0.05),同一字母表示不显著。

在图1统计结果基础上,得到发酵时间、K+浓度和Mg2+浓度的主效应图(图3),其中发酵时间和Mg2+浓度呈正效应,随水平的增加芽孢率增加,而K+浓度呈负效应,随着K+浓度增加,芽孢率反而降低,此主效应图对下一阶段的最陡爬坡实验选定水平走向有着重要意义。其余没有显著影响的条件固定为:发酵温度30 ℃、接种量5%、种子菌龄12 h。

图1 芽孢率PB设计的标准化效应分析Fig.1 The standardized effect analysis of the rate of spores in the experiment of Plackett-Burman design

图2 芽孢数PB设计的标准化效应分析Fig.2 The standardized effect analysis of the number of spores in the experiment of Plackett-Burman design

图3 芽孢率PB设计的主效应图Fig.3 The main effects plot of the rate of spores in the experiment of Plackett-Burman design

2.2 最陡爬坡实验确定转折点

根据Plackett-Burman设计实验中结果可知,其中发酵时间和Mg2+浓度呈正效应,K+浓度呈负效应,在此基础上调整水平范围,设计6组实验,以确定响应面实验的转折点,具体实验结果见表2。

由表2可知,以芽孢率为指标时,第1组、第5组和第6组实验之间不存在显著差异,而第2组、第3组和第4组之间也不存在显著差异,但是第1、5和6组芽孢率显著低于第2、3和4组,其中第3组的芽孢率最佳,为95.25%。

以芽孢数为指标时,第3组的芽孢数最高,芽孢数达到2.18×108CFU/mL。综合芽孢率和芽孢数的指标,均为第3组实验的结果最佳,因此选定第3组的因素水平,即:发酵时间为42 h,K+浓度为0.004 mol/L,Mg2+浓度为1.5 g/L。

2.3 响应面分析法确定最大响应值

以最陡爬坡实验确定的最佳条件为中心,以芽孢率为主要指标,芽孢数为辅助指标进行进一步Box-Behnken设计的响应面优化实验。

表3 芽孢率和芽孢数的Box-Behnken实验设计及结果Table 3 The Box-Behnken experimental design and results of the rate and number of spores

表4 芽孢率响应面实验的方差分析Table 4 The variance analysis of the rate of spores in response surface experiment

注:*表示差异“显著”(p<0.05),**表示差异“极显著”(p<0.01),表5同。

由表3可知,以芽孢率为指标时,第12组实验结果为最优,但芽孢数并不是最佳。而以芽孢数为指标时,第5组实验的实验结果最佳,芽孢数达3.97×109CFU/mL,且芽孢率能达到99.1%,仅次于第12组实验中的芽孢率。但运用Minitab 16.0 软件进行进一步的统计学分析,芽孢数的分析结果如表5所示,模型中回归和线性p>0.05,均无显著意义,即:芽孢数既不存在直线回归关系,也不存在曲线回归关系,换而言之,芽孢数的统计结果显示其并无统计学意义。因此,地衣芽孢杆菌BL-5的进一步优化不再以芽孢数作为指标参考。

在芽孢率的响应面实验结果中(表4),回归有着极显著的统计学意义,而线性并无显著意义,说明芽孢率的响应优化结果是曲线回归。平方和交互作用均为显著,尤其是平方极显著,故芽孢率的响应面实验可以进行进一步的分析。

通过对运用Minitab 16.0 软件对地衣芽孢杆菌BL-5的芽孢率进行回归分析,对实验数据进行回归拟合,得到二次回归方程:

Y=86.533+19.021X12-22.204X22-16.654X32+15.925X2X3

其中:X1-发酵时间;X2-K+浓度;X3-Mg2+浓度。

其中决定系数R2=88.87%,说明这种实验方法比较可靠,回归拟合程度较好,可以用此模型对芽孢率进行预测。

根据回归方程,运用Minitab 16.0 软件,作出以发酵时间、K+浓度和Mg2+浓度任一一个因素的水平不变,另外两个因素对芽孢率的影响的响应面曲面图和等高线图[17],见图4。

如图4所示,当保持Mg2+浓度为1 g/L时,发酵时间和K+浓度对芽孢率的响应面曲线图呈弧形的弓曲面,等高值线呈双曲线的规律。另外根据芽孢率在等高值线上的变化,显示发酵时间和K+浓度并无交互作用,反而呈现各自的平方具有显著意义。

当保持发酵时间为36 h时,K+浓度和Mg2+浓度对芽孢率的响应面曲线图呈规则弧形图,且K+浓度和Mg2+浓度对芽孢率的交互作用随着K+浓度和Mg2+浓度升高,响应值芽孢率呈现先增大后减小的趋势,表明两因素的交互作用显著。

当保持K+浓度为0.002 mol/L时,发酵时间和Mg2+浓度对芽孢率的响应面曲线图也是呈弧形的弓曲面,等高值线呈双曲线的规律。根据芽孢率在等高值线上的变化,表明两因素并无交互作用,只是各自平方的显著影响芽孢率。

表5 芽孢数响应面实验的方差分析Table 5 The variance analysis of the number of spores in response surface experiment

图4 芽孢率的响应面图和等高线图Fig.4 The response surface and contour plots of the rate of spores

最终由Minitab 16.0软件,以最优芽孢率为目的,进行响应优化的最佳发酵条件为:K+浓度为0.002 mol/L,Mg2+浓度为1 g/L,发酵时间为36 h。对此优化条件进行验证实验,重复3次实验,结果得到地衣芽孢杆菌BL-5的产芽孢率平均值为94.67%,芽孢数为3.32×109CFU/mL,优化结果较为理想。因而,可认为基于响应面分析法所得到地衣芽孢杆菌BL-5产芽孢率优化发酵条件参数准确可靠,具有一定的实际应用价值。

3 结论

在前期单因素实验的基础上以芽孢率和芽孢数为指标进行优化,经PB实验设计、最陡爬坡实验和响应面实验,得到最佳发酵条件为:K+浓度为0.002 mol/L、Mg2+浓度为1 g/L、接种量5%、种子菌龄12 h,发酵温度30 ℃、发酵时间为36 h。对确定的最佳发酵条件进行验证实验,结果得到地衣芽孢杆菌BL-5的产芽孢率平均值为94.67%,芽孢数为3.32×109CFU/mL。

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Optimization of fermentation conditions of spores production ofBacilluslicheniformisBL-5

ZHANG Li-li1,XU Yun-he1,XIAO Hai-di1,WANG Lin-feng1,HUANG Tao1,CHEN Wen-ying1,2,*

(1.College of Food Science and Engineering,Jinzhou Medical University,Jinzhou 121001,China;2.School of Public Health,Zunyi Medical University,Zunyi 563000,China)

Bacilluslicheniformis,as one member of probiotics,has broad application prospects in the food and feed industries. According to the number and rate ofBacilluslicheniformisBL-5 spores,the optimal conditions of fermentation was acquired via the Plackett-Burman experimental design,steepest ascent experimental design,and response surface experiment. And the results showed the optimized conditions were K+concentration of 0.002 mol/L,Mg2+concentration of 1 g/L,inoculation amount of 5%,inoculating age of 12 h,fermentation temperature of 30 ℃,fermentation time of 36 h. The optimum condition was verified,the rate and number ofBacilluslicheniformisBL-5 spores were 94.67% and 3.32×109CFU/mL,respectively.

BacilluslicheniformisBL-5;the rate of spores;the number of spores;response surface methodology

2016-08-20

张莉力(1977-)，女，博士，副教授，研究方向:微生物,E-mail:lilyzhang1977@163.com。

*通讯作者:陈文莹(1989-)，女，硕士，研究方向：微生物，E-mail:chenxiaomi1006@163.com

辽宁省自然科学基金项目(2014022046);国家自然科学基金项目(31301499)。

TS201.3

A

:1002-0306(2017)03-0150-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.03.020