杨梅素体外作用于人肝癌HepG—2细胞的研究

黄清玲++李宏伟

摘 要：目的：主要考察研究杨梅素（Myricetin）对人肝癌细胞株HepG-2增殖的影响。 方法：主要通过MTT比色法，觀察24 h，48 h，72 h不同浓度杨梅素作用HepG-2后细胞的生长情况，确定最佳作用时间；通过MTT、SRB法观察杨梅素作用于人肝癌HepG-2细胞72h后的影响，考察杨梅素对HepG-2细胞增殖的影响。结果：人肝癌细胞HepG-2经杨梅素处理作用72h的生长抑制最明显，并且浓度与抑制率间呈现明显的依赖效应，其IC50值为207.99 μmol·L-1。GI50，TGI，LG50分别为146.83 μmol·L-1，488.42 μmol·L-1和617.53 μmol·L-1。结论：结果表明杨梅素可抑制HepG-2细胞增殖，在一定浓度范围内呈剂量效应关系。

关键词：杨梅素；人肝癌细胞HepG-2；MTT；SRB

杨梅素（myricetin.Myr），是一种黄酮类化合物，有报道表明杨梅素具有降低神经毒性，影响淋巴细胞活化及增殖，拮抗血小板活化因子（PAF），降血糖，抗氧化和保肝护肝等多种生物学功能。Ching-Huai Ko等[1]人研究表明杨梅素对结肠直肠癌中基质金属蛋白酶2（MMP）的表达和活性有抑制作用，通过影响蛋白激酶C-α（PKC-α）的易位，细胞外信号调节激酶（ERK）的磷酸化和c-Jun的表达诱导结肠直肠癌细胞凋亡。对胰腺癌细胞信号传导途径PI3K/ATK有阻滞作用[2-4]。以上资料证明杨梅素是一种有效的致癌作用化学防治剂。本文以HepG-2细胞系为研究对象，利用SRB法和MTT比色法对供试药物杨梅素行体外抑制活性考察，并用SPSS15.0对两种筛选方法得到的实验结果进行差异性分析。以期探明抗杨梅素体外筛选中SRB法和MTT比色法实验结果的相互验证作用，实现杨梅素体外筛选结果的准确可靠[5-6]。

1.实验材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞株

人肝癌细胞（HepG-2）由哈尔滨商业大学药物研究所博士后科研工作站传代保种。

1.1.2细胞培养

实验所用细胞在含5%CO2的37C培养箱中培养传代，用含10%胎牛血清的RMPI 1640培养液培养；用0.25%胰酶-EDTA消化传代，每周传代两次。

1.2试验方法

1.2.1.MTT法测定杨梅素对人肝癌HepG-2细胞增殖的影响

实验步骤：

将对数生长期的细胞用胰酶消化后配制成浓度为5×104细胞/ml的细胞液；按5000个/孔接种于96孔板，每孔加100 μl，置于37℃、5%CO2孵箱中培养24h；次日加入含不同浓度药物及相应溶剂对照的新鲜培养基，每孔加100 μl（DMSO终浓度<0.5%），每药设6个剂量组，阿霉素（ADM）17 μmol·L-1作为阳性对照组，每组6个平行孔。置于37℃、5%CO2孵箱中培养72h。弃上清，用培养液洗3次，以去除药液。每孔加100 μl新鲜配制的含0.5 mg/ml MTT的无血清培养基，继续培养4h。小心弃培养上清，每孔加200 μl DMSO溶解MTT甲簪沉淀，用微型振荡器振荡混匀。用MK3型酶标仪在参考波长490 nm，检测波长570 nm条件下测定光密度值（OD），以溶剂对照处理的肿瘤细胞为对照组，用下面公式计算药物对肿瘤细胞的抑制率，并按中效方程计算IC50：

1.2.2.SRB法测定杨梅素对人肝癌HepG-2细胞增殖的影响

基本原理：

Suforhodamine B（SRB）是一种蛋白质结合染料，粉红色，可溶于水。SRB可与生物大分子中的碱性氨基酸结合，其颜色变化与活细胞蛋白呈正比。同时，其在515nm的OD值与细胞数呈良好的线性关系，故可用作细胞数的定量。

实验步骤：

将对数生长期的细胞用胰酶消化后配制成浓度为2×104细胞/ml的细胞液，按1000个/孔接种于96孔板，每孔加100 μl。培养24小时后加入待测药物，同时测定此时细胞的OD515值（T0）。加药72小时后进行测定：每孔加预冷的50%三氯乙酸（TCA）液50 μl固定（TCA终浓度10%），静置5分钟，将96孔板移至4℃放置1小时；倒掉固定液，去离子水洗5遍，空气干燥后，每孔加SRB液100 μl（用1%醋酸配成4mg/ml溶液），室温放置10分钟；1%醋酸洗5遍，空气干燥后，加150 μl 10mmol/L非缓冲Tris碱液（pH10.5）溶解，稳定10 min后测定OD515 nm值。按中效方程计算细胞50%生长抑制所需的药物浓度（GI50）；细胞完全生长抑制所需的浓度（TGI）；杀死50%细胞所需药物浓度（LC50）。

统计学处理

实验结果以均数±标准差（x±s）表示，多组比较采用方差分析，组间两两比较采用S-N-K法。所有实验结果采用SPSS15.0统计学软件分析，以P<0.05为差异具有统计学意义，P<0.01为差异具有显著性统计学意义。

2.结果与讨论

2.1.MTT实验结果与分析

活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物（formazan）并沉积于细胞中，而死细胞无此功能。DMSO能溶解细胞中的紫色结晶物，用酶标仪检测在560 nm波长处光吸收值，可间接反映活细胞数量。用MTT法观察了杨梅素对体外培养的HepG-2细胞生长的影响。从实验结果能够看出人肝癌细胞HepG-2经杨梅素处理24 h，48 h，72 h后，细胞生长明显受到抑制，随着给药时间和给药剂量的增加，细胞生长抑制率逐渐增大，72 h作用最明显。说明杨梅素对HepG-2细胞有明显的生长抑制作用，并且具有良好的时间剂量依赖关系。各处理组间比较皆有显著性差异（P<0.01）。其IC50值为207.99 μmol·L-1。

2.2.SRB实验结果与分析

经过SRB法检测，不同浓度杨梅素作用细胞72h后，细胞生长受到抑制，并且浓度与抑制率间呈现明显的依赖效应，各处理组间比较皆有显著性差异（P<0.01）。GI50，TGI，LG50分别为146.83 μmol·L-1，488.42 μmol·L-1和617.53 μmol·L-1。

3.结论

3.1.MTT法结果表明，经过杨梅素处理24 h，48 h，72 h的人肝癌细胞HepG-2生長受到抑制，随着给药时间和药物浓度增加，抑制率均有升高的趋势。经过比较，人肝癌细胞HepG-2经杨梅素处理作用72 h的生长抑制最明显，因此，将人肝癌细胞HepG-2作用时间定为72 h。

3.2.MTT法观察了杨梅素对体外培养的HepG-2细胞生长的影响。实验结果显示不同浓度杨梅素作用细胞72 h后，细胞生长受到抑制。并且浓度与抑制率间呈现明显的依赖效应，各处理组间比较皆有显著性差异（P<0.01）。其IC50值为207.99 μmol·L-1。

3.3.SRB法结果表明不同浓度杨梅素作用细胞72 h后，细胞生长受到抑制，并且浓度与抑制率间呈现明显的依赖效应，各处理组间比较皆有显著性差异（P<0.01）。GI50，TGI，LG50分别为146.83 μmol·L-1，488.42 μmol·L-1和617.53 μmol·L-1。

参考文献

[1]Ching-Huai Ko，Shing-Chuan Shen，Tony J.F.Lee， et al.Myricetin inhibits matrix metalloproteinase 2 protein expression and enzyme activity incolorectal carcinoma cells.Molecular cancer therapeutics. 2005，4：281～290.

[2] 徐春华. MTT法检测大豆异黄酮对癌细胞的生长抑制作用[J]. 中央民族大学学报（自然科学版）. 2012（01）.

[3] 银久，宋宝安，金林红，胡德禹，杨松，李宁，吴守伟. SRB法和MTT法抗肿瘤药物筛选结果相关性研究[J]. 生物学杂志. 2009（04）.

[4] 庄金秋，梅建国，杨丽梅，莫玲，沈志强. MTT法细胞计数中细胞接种量的确定[J]. 广东畜牧兽医科技. 2016（03）.

[5] 王英婷， 杨旭东，黄燮南.利用中效原理观察紫杉醇和木黄酮对子宫内膜癌JEC细胞的作用.肿瘤学杂志. 2011，02.

[6] 朱胜章，陆建波. 肿瘤细胞原代培养的应用与发展[J]. 肿瘤基础与临床. 2012（01）.