千里香植物组织培养的优化

徐红红++潘永玖++梁丽敏++李珊珊

摘 要：千里香为我国较常见的药用植物，有麻醉止痛，消肿解毒等功效。本实验以其新生幼叶及茎段为外植体，通过优化组织培养方法，筛选出适宜千里香生长的培养基体系，其中生长素的种类及含量对外植体的生长具有重要作用，同时，一定浓度的活性炭也可以有效地预防愈伤组织的褐化。经大量试验发现适合千里香生长的培养基为：MS +6-BA2.5mg/L+NAA0.5mg/L+活性炭0.5g/L；本次实验旨在为千里香的无土大面积栽培提供新的方法和途径，同时也为千里香在分子水平的研究提供无菌材料。

关键词：千里香；组织培养；优化；生长素

基金项目：广西高校右江流域特色民族药研究重点实验室（xzdsysyy2015304）；2014年右江民族医学院校级课题。

千里香（Murraya paniculata）又名七里香、万里香，为芸香科（Rutaceae）九里香属（Murraya）植物，原名小叶九里香，1978年黄成就将小叶九里香上升为种，更名为千里香[1]。千里香因具有耐旱不耐寒的特性而广泛分布于我国的广西、云南等高海拔温热潮湿地区，植物体为常绿灌木，具有麻醉止痛，活血散瘀等多种功效，是我国较常用的中草药材。国内外学者对千里香的研究较少，且多见于对其化学组份以及药理作用的探索，D.P. Chakraborty等人发现千里香植物体内含有一种新的香豆素抗生素[2]；Yao hua等人从千里香的叶子中提取了两种氧甲基黄酮，具有抗菌消炎作用[3]；闫江红等人利用HPLC法对千里香叶片中黄酮类成分含量进行了测定[4]。人们对该材料进行药理分析的同时，对其组织培养方面以及分子蛋白水平的研究甚少，国内外暂时还没有千里香植物组织培养的相关文献，通过本次实验，旨在为千里香进一步的分子水平以及蛋白水平研究提供无菌材料，提高其实验准确性和成功率，同时，也为植物组织培养技术提供新的方法和途径。

1材料采集

于2016年8月选择晴朗天气在广西省百色市境内进行材料的采集，选择生长健壮、污染较少、无病害的千里香植株，采摘带腋芽的茎段、带小叶柄的叶轴以及幼叶作为培养材料。

2方法

2.1外植體处理

将采集的实验材料用无菌水冲洗8min。其中带叶小柄的叶轴和带腋芽的茎段分割成长约1cm的茎段，嫩叶边缘全部剪掉，以便愈伤组织的生长，留下叶子的中心部分，约占原有叶子面积的一半以上。

2.2外植体消毒

将预处理好的外植体放入75%的酒精中，消毒8s，然后快速转入10%的次氯酸钠溶液消毒3min，然后用无菌水冲洗2次，再置于0.1%的氯化汞中消毒7min，之后用无菌水冲洗5次，最后将消毒后的外植体放在无菌滤纸上吸干表面水分后接种在胚芽诱导培养基中。

2.3培养基配置

诱导芽生长培养基

MS+6-AB2.5mg/L+NAA0.5mg/L+13g/L琼脂+30g/L蔗糖

增殖培养基

（1）MS+6-AB（1.5、2.0、2.5、3.0）mg/L+NAA0.5mg/L+13g/L琼脂+30g/L蔗糖+活性炭0.5g/L

（2）MS+6-AB2.5mg/L+NAA0.5mg/L+13g/L琼脂+30g/L蔗糖

（3）MS+6-AB2.5mg/L+NAA0.5mg/L+13g/L琼脂+30g/L蔗糖+活性炭0.5g/L

（4）MS+6-AB2.5mg/L+IBA0.1mg/L+13g/L琼脂+30g/L蔗糖+活性炭0.5g/L

2.4愈伤组织培养

初代外植体接种于诱导培养基中，培养条件为温度为26℃，光照16h，黑暗8h，光强为2500lx的培养箱中培养，定期观察和记录外植体的生长及变化。

2.5 6-BA浓度梯度试验

将长势一致、诱导良好的外植体分别转入不同浓度的6-AB（1.5、2.0、2.5、3.0）mg/L的MS增殖培养基（1）中培养，每浓度试验10瓶，培养30d。

2.6活性炭试验

将诱导良好的外植体分别移至不含活性炭以及含有活性炭的增殖培养基中（2、3增殖培养基），进行抑制褐化实验，每种培养基实验10瓶，培养15d，观察有无活性炭对外植体褐化影响。

2.7生长素种类试验

挑选长势好的材料放入含有一定浓度的IBA生长素的培养基中培养（4），每种接种10瓶，周期30d，与其他生长素进行对比。

3 结果与分析

3.1 不同6-BA浓度对愈伤组织的影响

6-BA为植物组织培养常用的细胞分裂素，可以有效促进细胞进行分裂，经过查阅相关文献发现植物在组织培养过程中，该生长素的使用含量差异较大，例如林茜等人对四数九里香植物组织进行培养过程中[5]，6-BA增长浓度为1.0mg/L。王小敏等人在两面针的组织培养与快速繁殖中[6]，6--BA的增长浓度为2.0mg/L，因而本实验利用不同的浓度梯度培养，最终筛选出最适宜千里香生长的6-BA浓度为2.5mg/L。由表1可知，当外植处于不同浓度的6-BA培养基时，外植体均可长出愈伤组织，而当6-BA浓度为2.5mg/L时，培养基的发芽率最高，当6-BA浓度大于或者小于该浓度时，培养基的发芽率均明显下降，因而，2.5mg/L6-BA浓度为最适宜培养千里香的浓度。

3.2 不同生长素种类对愈伤组织的影响

NAA、IBA均为植物组织培养常用的生长素，通过实验对比，外植体处于不同培养基中发芽率略有不同，由表2可知，当外植体处于含有生长素NAA的MS培养基中，发芽率优于含生长素IBA的培养基，分析原因可能是INA促进愈伤组织生根，尤其是不定根的生长，以及外植体的生长效果等方面略低于生长素NAA。

x3.3 活性炭（AC）对愈伤组织褐化的影响

实验发现，在千里香组织培养的各个时间段均有褐化的现象发生，这在一定程度上影响了千里香的生长，有实验表明，褐化的发生及褐化程度对外植体的生长有一定的影响[7]，其中相对较大的材料褐化程度较轻，而较小的材料更容易发生褐化[8]。有报道称，低浓度下的活性炭可以吸附培养基中的多酚氧化物及有毒物质，所以可以有效地防止外植体的褐化[9]。通过比较有无活性炭发现，当添加0.5mg/L的活性炭时，可以很好的抑制外植体褐化（图1和图2）。

3.4 温度和光照对愈伤组织的影响

有研究发现，低温条件可明显降低褐化率，而高温培养却促进褐化的发生，当温度较高时褐化率达52.7%[10]。但千里香适宜在温热潮湿的环境中生长，因而，选择的组织培养温度为26℃，外植体的褐化率较低，同时也符合千里香的生長环境。

培养光照不适亦对外植体的生长产生影响，赵伶俐等人研究结果表明，2000lx光强培养的外植体褐化率较严重，1000lx和3000lx光强培养可降低外植体的褐化率[11]，因而，本次实验选择2500lx光强，既可以有效降低褐化率也可以促进外植体生长。

4 结语

现代植物组织培养较常用的生长素包括6-BA、NAA、IBA，其中6-BA可促进外植体的腋芽伸长生长，NAA可促进外植体的生根，本次实验筛选出适宜千里香外植体进行组织培养的生长素浓度为6-BA2.5mg/L、NAA0.5mg/L，同时，也验证了活性炭可有效抑制外植体发生褐化反应，增加植物体的成活率，因而较为适宜千里香组织培养的培养基为MS+6-BA2.5mg/L+NAA0.5mg/L+活性炭0.5mg/L。千里香是我国的一味中草药材，有行气活血、解毒消肿、散瘀止痛等功效，但人们主要研究其化学组成，至今还没有看到相关组织培养的文献，通过本次实验，筛选出千里香较为适宜的外植体生长环境，将为千里香的无土栽培和进一步的分子实验提供材料，也为其他植物的组织培养提供参考。

参考文献

[1]黄成就.中国芸香科植物资料[J].植物分类学报，1978，16（2）：85.

[2]Chakraborty DP，Roys，Chakraborty A，etal.Structure and synthesis of mexolide a new antibiotic dicoumarin from Murraya exotica synonym Murraya paniculata[J].Tetrahedron，1980，36：3563-3564.

[3]Yao Hua，Jin yongri，Shan Jing，etal.Two New Natural Methoxyflavonoids from leaves of Muray apaniculata（L）Jack.

[4] 闫江红，马彦冬，王晓中，等.HPLC法测定千里香叶中黄酮类成分的含量[J].药物分析杂志，2008，28（10）：1630-1633.

[5] 林茜，高营营，韩晓华，等.四数九里香组织培养[J].亚热带科学，2015，44（1）：70-71.

[6]王小敏，蒋波，徐敏慧，等.两面针的组织培养与快速繁殖[M].玉林师范学院学报，2005，26（5）：70-73.

[7] 李凤兰，胡国强，胡宝忠.八种不同花色一串红组织培养快繁的研究[J].生物技术，2005（4）：71-73.

[8] 陈菲，李黎，宫伟.植物组织培养的防褐化探讨[J].北方园艺，2005（2）：69.

[9] 王栋，玉永雄，胡艳，等.植物组织培养中的褐化现象及其防止措施[M].生物技术，2008（1）：7-10.

[10] 刘兰英.核桃的组织培养和快速繁殖[J].植物生理学通讯，2000（5）：434-435.

[11] 赵伶俐，葛红，范崇辉，等.不同光照强度对蝴蝶兰组培中外植体褐化的影响[J].北方园艺，2006（4）：160-161.

作者简介：徐红红（1988.03），女，黑龙江省鹤岗人，硕士，助教，从事千里香组织培养及遗传转化工作。Emall：476486500@qq.com

通讯作者：潘永玖，Emall：345090614@qq.com