同源重组介导的重组病毒研究进展

赵银龙+李健+朱海霞

摘要：病毒同源重组是以同源臂为基础的将目的基因整合到病毒基因组中的技术。将表达盒串联到转移载体，通过同源重组构建重组病毒从而实现病毒基因改造、外源基因表达以及重组活载体疫苗制备等。就重组病毒的优缺点、构建原理及应用进展进行了概述，对重组病毒构建的难点进行了分析，全面系统地阐述了重组病毒的構建模式，针对基因框（启动子-报告基因-目的基因-调控元件-终止子）给出具体的构建方案，同时对其未来发展前景进行了展望，以期为今后重组病毒的构建提供理论基础。

关键词：同源重组；表达盒；转移载体；重组病毒；病毒载体

中图分类号： S852.65 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2016）11-0001-05

病毒分子生物学和免疫学的发展使得从事病毒研究的人员得以从分子水平上对微生物的基因进行克隆和表达，对病毒进行体外改造逐渐成为现代病毒分子生物学研究的热点之一。国内外学者利用DNA重组技术先后开展了包括亚单位疫苗、合成肽疫苗和核酸疫苗等新型疫苗的研究，并取得了一定的成果，但这些疫苗大多免疫原性较低。后来人们利用基因工程技术将免疫原性基因插入病毒（如腺病毒、痘病毒、伪狂犬病毒等）构建活载体病毒，可产生一种具有常规弱毒疫苗和灭活苗效果的基因工程活载体疫苗。重组病毒作为疫苗可以部分模拟病毒入侵机体的过程，将病原的保护性抗原编码基因片段或者重组多肽克隆入载体，诱导产生特异性反应，使机体产生相应的细胞免疫和体液免疫。

重组病毒的构建是建立在体外同源重组的基础上，筛选一个含亲本毒株的复制非必需片段，通过质粒转移载体与病毒基因组DNA之间的同源重组将外源基因导入病毒基因组中，既保留了亲本毒株的生物学特性，又可使重组病毒得到复制增殖。目前，已有多种表达病原蛋白的重组病毒构建成功，表达FMDV衣壳蛋白前体的P1-2A基因和蛋白酶3C基因的rPRV TK-/gE-/P1-2A-3C，能诱导产生高水平的中和抗体和FMDV特异的淋巴细胞反应[1]。在国内，郭万柱教授率先系统地开展了伪狂犬病病毒（PRV）分子生物学研究[2]。同源重组是基因工程中常用的技术手段，在基因打靶和基因克隆方面具有重要作用。但该技术应用于重组病毒研究又不同于反向遗传操作技术（病毒拯救）、RNA干扰和PCR改造等，该方法避免了基因的直接体外操作，不会引入额外的DNA序列，简化了试验步骤。Rumenapf等利用杆状病毒囊膜糖蛋白GP64的跨膜区域（TM）和细胞质区域（CTD）在小鼠和猪中表达JEV的E蛋白也能诱导产生高效价的特异性抗体[3]。利用鸡痘病毒成功表达了多种禽类病毒的保护性抗原基因，如IBDV的VP2基因、MDV的gB基因、AIV的HA基因、NDV的HN和F基因及REV的env基因等[4-8]。

1 转移载体构建原理

1.1 表达盒的构建

为了将外源基因插入亲本病毒基因组，使构建的重组病毒能真实有效地表达，必须串联启动子、增强子、标记基因、终止子和Poly（A）等反应元件（图1）。其中启动子最为重要，决定着外源基因的表达水平。一般构建表达盒带有真核启动子CMV、T7和SV40等就能顺利启动外源基因，也可以串联2个启动子。而痘病毒应用病毒自身的转录系统在胞浆内复制，所以外源基因的表达要求使用痘病毒自身的内源启动子 P7.5/11[9-12]。P7.5/11为早晚期串联启动子，其结构独特，最重要的是P7.5/11非常保守，在痘病毒科重组病毒领域有广阔的应用前景[13]。另外，采用独立的早晚期启动子分别启动报告基因和外源基因的表达（图2），避免了翻译时通读的发生，增加了重组病毒的稳定性。由于重组病毒表达的外源蛋白是宿主免疫反应的目标，因此使用病毒的晚期启动子表达外源基因有利于病毒逃避宿主的免疫反应，建立持续感染[9]。

如果能在同一载体中插入来自不同病原的保护性抗原基因，实现多种抗原的共表达，这样既可以同时对多种疾病进行预防，又可以避免疫苗载体之间的相互干扰，最大限度地发挥重组病毒的效用（图3）。重组病毒在遗传上可能不稳定，连续传代后位于相同启动子之间的外源基因可能丢失[14]。为了降低重组病毒的遗传不稳定性，并克服多个相同启动子之间可能存在的干扰现象[15]，在1个MFG载体上使用了2个IRES元件，使3个外源基因同时得到有效表达。目前，研究外源基因多是B细胞表位和T细胞表位、抗原肽等。进一步研究表明，应用免疫转移电泳法也确定了许多病毒中和抗原的主要结构蛋白均为衣壳蛋白和糖蛋白，它们暴露于病毒粒子表面，可以诱导机体产生中和抗体[16]。由于传统灭活疫苗是外源性抗原，不能通过MHCI类抗原递呈途径来有效激活T淋巴细胞，诱导的细胞免疫水平较低，因此利用病毒载体表达病原体抗原基因和适当类型的细胞因子，通过表达细胞因子来发挥特定的免疫调节作用以提高重组病毒免疫效力，很多研究者在设计的抗原基因中增加了Th刺激因子，如2B、3ABC、3D、IFN-γ以及IL-1等部分序列[17]。

1.2 外源基因的靶向位点

作为良好的重组表达系统，亲本病毒复制非必需区的克隆与筛选是先决条件。亲本病毒基因组庞大，其中许多基因是病毒复制非必需的，可供作为外源基因靶向位点。但是，外源基因在不同的部位插入病毒基因组，可能会产生不同的效果。通常是构建某段基因缺失的同源重组臂，这些基因是病毒的主要毒力基因，删除相关的基因，使其不带毒力或致弱毒力；但是病毒粒子仍然保持较好的抗原性，可以组装成成熟的病毒粒子，为下一步重组病毒做准备。在重组痘病毒、腺病毒、猪伪狂犬病毒和传染性喉气管炎病毒等研究中，广泛采用了TK[18]、US2[19]、US10[19]、gB[20]、gD[20]、E3[21]、FL11[22]等外源基因的靶向位点。最初确定非必需区常常采用鸟枪法，盲目地克隆病毒基因组，再用于筛选，工作量大且繁琐。随着各病毒全基因组的逐渐公布，复制非必需区遗传背景研究的深入，为确定非必需区的研究建立了丰富的理论基础，可以实现仅用PCR技术就能获得靶向位点，容易进行遗传操作。同源臂的长短也是影响重组病毒构建的重要因素，一般情况下在0.13～6.00 kbp之间都可以进行有效的重组，Amano等采用 P7.5 启动下的lacZ作为报告基因，检测同源臂长度对于转染效果的影响，当片段长度在0.73～4.50 kbp范围时，获得同源重组得到重组病毒的概率为0.073%～0.620%，说明重组的效率主要和同源臂的长度有关，和插入的基因无关[23]。

同源臂的构建策略分为2类（图4）。一类是外源基因靶向位点（TK为例）左右各延伸1段基因片段，因复制非必需区中包含酶切位点，单酶切后平末端需要Klenow补平，CIP去磷酸化，再去串联表达盒（图5），此方法连接效率低，影响同源重组；另一类是分别延伸靶向位点两侧的基因，构建非必需區中间缺失的同源臂（图6）。人为引入酶切位点，有利于连接，提高同源重组水平，为随后的重组病毒构建提供可靠的材料保证。

1.3 同源重组

利用PCR技术以病毒基因组为模板克隆目的基因，构建亲本病毒某段非必需区缺失的突变株，含左右同源臂。由于亲本病毒一般基因组庞大，而且基因组DNA又没有感染性，不便直接操作，通常是将转移载体分开构建，既可以保证将外源基因灵活地插入转移载体，也可以准确地选择合适的其他反应元件，得到表达盒和同源臂2个独立的系统，解决病毒构建的前期工作。各个反应元件都需要适合的酶切位点进行串联。最后将构建好的含有表达盒的转移载体和脂质体共转染病毒预先感染的哺乳动物细胞，完成同源重组。基于所设计的转移载体特性，传统的同源重组方法是亲本病毒感染哺乳动物细胞后再转染。这种方法虽然可以产生重组病毒，但将亲本病毒和重组病毒分开较难，因为重组效率本身低，重组病毒与亲本病毒相比更不具有生长优势，因而需要筛选多代才能获得纯化的重组病毒。目前常采用转移载体和亲本病毒基因组共转染的方法，一般经3代筛选即可获得具有感染活性的重组子，方便以后重组病毒高效地表达外源基因[24]。

利用病毒存在广泛的复制非必需区，构建1个或多个不同病原体保护性基因的重组病毒。但病毒载体核酸序列较长，对病毒基因进行酶切和直接连接外源基因等遗传操作比较困难，因此，同源重组在构建重组病毒的研究中崭露头角。实际上重组病毒的效率不高，涉及诸多影响因素：（1）病毒载体的选择。重组子表达的量依赖于亲本病毒DNA的复制情况，由于病毒的复制能力具有较强的种类特异性，需要选择适合的载体构建不同的重组病毒。（2）外源基因的长短。插入的目的片段太长时，同源重组的效率很低，只有较短时才比较有效。（3）同源臂的长短。研究表明常用的左右同源臂片段约是 1.0 kbp，过长或过短都会影响重组。（4）就基因表达调控机理和重组活疫苗的生物安全而言，应首选病毒自身的启动子，但是应用中要选择强启动子，才能使病毒滴度增高，外源基因在细胞中得以有效表达，并且有良好的免疫原性和遗传稳定性。（5）表达盒的串联方式多种多样，可以双启动子顺向连接、双启动子反向连接、双标记基因等。如果标记基因的启动子和另外一个外源基因的启动子是不同的，那么2个启动子无论相对位置如何，各自的启动效率和重组病毒的稳定性都是一样的，但如果2个启动子是相同的，且启动子的2个基因顺向连接，那么重组病毒在传代的过程中就有可能发生分子内的启动子同源重组，将2个启动子之间的基因剪除，从而失去这一基因的表型。最终能筛选得到不带选择标记的重组痘苗病毒，并具有筛选周期短、工作量小、较能准确筛选重组病毒等优点，非常适用于疫苗株的构建[25]。

1.4 重组病毒的筛选

以报告基因对表达盒的功能进行验证，筛选出具有高效表达蛋白能力的重组病毒。常用的途径：（1）β-半乳糖苷酶基因（LacZ）是来自大肠杆菌乳糖操纵子中的一个基因，其最大的优势是易于用组织化学法检测其原位表达，而且其表达产物对细胞的存活和生长基本无毒性作用。但由于LacZ基因组较大，约3.1 kbp，串联它时很困难，外源基因表达盒构建会受影响。（2）gpt（黄嘌呤鸟嘌呤磷酸转移酶）也是常用的筛选标记之一。由于在鸟嘌呤合成途径中，催化IMP到XMP反应的是IMP脱氢酶，而MPA是该酶的不可逆阻断剂。鸟嘌呤只能通过替代途径在gpt的参与下合成。动物细胞本身不能合成gpt，但重组的病毒可以提供gpt从而使病毒完成核酸代谢，使细胞分裂得以生长、增殖[26]。（3）GFP来源于海洋生物水母，EGFP是一种优化的突变型GFP，它所产生的荧光要比野生型GFP强35倍，大大增强了该报告分子的灵敏度[27]。作为动植物以及微生物基因工程研究上的一种选择性标记，它具有检测灵敏度高、操作简便、对机体毒性小且不需要任何底物或辅助因子等优点[28]。（4）胸腺嘧啶脱氢核苷激酶（thymidine kinase，TK），是核苷酸合成补救中的一种酶，能把胸苷转化为胸苷磷酸，保证核苷酸的顺利合成。在HAT选择培养基中，TK基因缺陷受体细胞不生长，相反外源基因转化细胞生长。这种筛选系统前提是单一选择TK基因作为非必需片段构建重组病毒，不能被广泛采用，十分局限。

2 病毒活载体的应用

载体是供插入目的基因并将其导入宿主细胞内表达或复制的运载工具。近几年，以病毒载体为基础构建的重组活载体疫苗成为疫苗研究领域的主要方向[29]。目前，作为载体的病毒多为哺乳动物病毒，如腺病毒（adenovirus）、伪狂犬病毒（Pseudorabies virus）、痘病毒（Pox virus）、杆状病毒（baculovirus）等，其中杆状病毒表达载体系统也是应用同源重组技术，是近些年研究的热点。

2.1 腺病毒载体

腺病毒（adenovirus，Adv）属于腺病毒科，线状、无包膜的双链DNA病毒，基因组大小约36 kbp，由240个六邻体和12个五邻体构成二十面体病毒壳体。五邻体位于二十面体顶角，均有1个纤维蛋白突起与其相连，纤维蛋白头部与腺病毒的组织亲合性密切相关。腺病毒感染细胞分4个阶段：感染、早期事件、晚期事件和包装。

第1代腺病毒E1/E3基因表达盒，插入外源基因的长度可达8 kbp。去除E1区阻止了依赖E1区和E2区功能蛋白的转录与随后病毒DNA的复制及病毒外壳蛋白的产生，这种方法效率很低[30]。第2代腺病毒建立在第1代基础上，在E1、E3缺失的基础上进一步去除E4区，减弱病毒自身蛋白表达，降低炎症反应。第3代腺病毒载体又称辅助病毒依赖型腺病毒载体（helper-dependent adenovirus，HD-Ad）[31]，表达系统分为3部分：（1）空壳载体；（2）腺病毒自身编码序列；（3）辅助病毒。外源DNA的装载容量提高，表达外源基因时间延长。

2.2 猪伪狂犬病毒载体

猪伪狂犬病毒（PRV）属于疱疹病毒科中的猪疱疹病毒型。病毒基因组为线状双链DNA，长度为150 kbp，由长独特区（UL）、短独特区（US）、US两侧的重复序列（TRS）、内部重复序列（IRS）组成。猪伪狂犬病（PR）是由猪伪狂犬病毒（PRV）引起的急性传染病，每年给养猪业造成巨大的经济损失，多种家畜和野生动物均可被感染[32]。对猪伪狂犬病的控制主要是使用疫苗。猪伪狂犬病毒以其特殊的基因组结构、宿主的广泛性和生物安全性成为研制活载体疫苗的重要载体工具。

目前，PRV基因缺失疫苗株常常是通过缺失gE、gI、gG、gC、TK等非必需基因，缺失分为单基因缺失和多基因缺失。Zhang等构建了表达口蹄疫病毒衣壳前体肽P12A和非结果蛋白3C的伪狂犬病毒载体疫苗（PRV-P12A3 C），结果表明部分仔猪的临床症状减轻，囊泡出现延迟[33]。

2.3 痘病毒

2.3.1 鸡痘病毒载体 鸡痘病毒（Fowlpox virus，FPV）基因组大小为288 kbp，基因组是双链DNA，包括1个由相同的2个9.5 kbp大小的末端倒置重复序列包围的核心编码区，它含有260个开放阅读框，大小为260～309 kbp，比其他已报导的脊椎动物的基因组都大。过去对FPV基因组的研究工作，主要是利用纯组织培养的FPV传代毒株，并且获得了约1/3的病毒基因组信息，包括免疫逃避假说和宿主范围功能。鸡痘病毒（FPV）是近些年來研究开发并逐渐转向实际应用的一种新的病毒载体。为了设计更安全、有效、合理的FPV疫苗和以FPV为基础的表达载体，要求研究者对与病毒毒力和宿主范围有关的基因有一个全面的认识，对这些基因在病毒致病机理、免疫逃避和宿主范围方面的作用有深入的了解。

对于鸡痘病毒载体研究的内容主要集中在鸡痘病毒载体启动子的优化，提高外源基因在鸡痘病毒载体中的表达需要强启动子，FPV自身启动子研究还不够详细、表达量偏低。目前大部分鸡痘病毒载体都选用痘苗病毒（Vaccina virus，VV）的早、晚期启动子[34]。

2.3.2 羊痘病毒载体 羊痘病毒是痘病毒科（Poxviridae），脊索动物痘病毒亚科（Chordopoxrinae），羊痘病毒属（Capripox virus）成员。基因组由共价结合的双股DNA组成，基因组呈线性，全长约150 kbp，DNA无感染性，编码至少147种基因。病毒基因组保守区的非复制区域可以整合外源DNA，羊痘病毒是继痘苗病毒和禽痘病毒（Fowlpox virus，FPV）之后一种重要的动物病毒载体，因为对人不具有感染性，对外源基因的耐受性强，是一种更为理想的活病毒载体。羊痘病毒毒力有关基因如胸苷激酶基因（TK）、核苷酸还原酶基因（RR）、蛋白激酶基因（RK）和P32基因等。TK基因缺失不影响病毒的增殖，却能显著降低病毒毒力，TK基因缺失的羊痘病毒被广泛地应用于疫苗的研究中。

羊痘病毒基因组庞大复杂，不易在某一个特定的位置直接插入外源基因，所以要先利用1个质粒载体构建1个转移载体。不仅可以预防羊痘的发生，还可以插入其他外源病毒保护性抗原，重组病毒所表达的外源基因随载体病毒复制、转录、蛋白合成加工，诱导产生针对相应病原的免疫应答。Diallo 等构建了表达小反刍兽疫病毒（Peste des petits ruminants virus，PPRV）H基因的重组山羊痘病毒，动物试验中需要 10 TCID50 才能保护小反刍兽疫[35]。张强等构建了 Asia1 型口蹄疫病毒P1-2A和3C基因的重组山羊痘病毒弱毒株[36]。

2.3.3 痘苗病毒载体 痘苗病毒基因组的大小约为 187 kbp，可以编码150～200种多肽，包括早期蛋白和晚期蛋白。以侵入细胞后病毒DNA开始复制的时间为界，人为地将病毒复制分为早期和晚期2个过程。其中应用得最多的是早、晚期蛋白启动子P7.5。而痘苗病毒基因组允许插入较长的外源DNA片段（25 kbp）并且不会造成病毒感染性的丧失[37]。目前有很多痘苗病毒毒株用作载体表达各种类型的外源基因，较为常用的毒株是痘苗病毒WR株（western reserve strain）。此外，还有很多毒株如痘苗病毒天坛株[38]、Wyeth株、Copenhagen株及NYCBH株等。

2.4 杆状病毒载体

杆状病毒（baculovirus）是一类具有囊膜包裹的双链环状DNA病毒，自然界中主要感染鳞翅目、膜翅目和双翅目昆虫。其基因组大小为80～160 kbp，位于直径为30～60 nm、长 300 nm 的杆状核衣壳中，具有较大的柔韧性，可以容纳较大片段的外源基因插入。苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（Autographa californica multicapsid nucleo polyhedro virus，AcMNPV）是众多杆状病毒中研究最多的。它异于其他病毒载体，成为病毒载体研究热点是因为杆状病毒表达载体适合翻译后修饰和重组蛋白的高水平表达。有研究发现，昆虫杆状病毒可以进入多种哺乳动物细胞，并在合适的哺乳动物启动子控制下表达外源基因，但其基因组在细胞中不复制，且对哺乳动物细胞的生长无明显影响[39]。Lu等研究发现含有PRRSV ORF7的C端编码区域的特异shRNA的VSV-G假型化杆状病毒成功地抑制了PRRSV在Marc145细胞中的复制[40]。Starkey等构建了表达乙肝病毒（Hepatitis B virus，HBV）特异的shRNA重组杆状病毒，在体外能成功地阻断HBV复制[41]。由于杆状病毒具有最理想疫苗转移载体的典型特征，所以杆状病毒作为哺乳动物基因转运载体不断发展，研究也表明杆状病毒载体是疫苗发展过程中极其有效的工具。

3 重组病毒的优、缺点

新型重组病毒不断涌现，不但保持了原有病毒的优点，更对许多不足之处作出了重大改进，从而使这方面的研究有了新突破，重组病毒表达外源基因的优点在于：（1）宿主范围广，可用于多种动物，也包括人类。（2）有大量的非必需片段可用作插入外源基因的位点，方便串联表达多个目的片段，构建多价苗。（3）免疫期长，可对机体产生持久的免疫力。（4）安全性好，易于被人们接收，目前常采用基因操作技术，将病原微生物中与致病性有关的毒力基因敲除或插入其他外源基因，使之成为无毒株或弱毒株。（5）重组毒易于大量生产、成本低、保存和使用相对比较方便。（6）诱导位点专一，免疫方式简单、易控制。但是在实际应用中也发现，重组病毒目前也存在许多不可忽视的缺点：（1）与临床要求相比，病毒滴度低。（2）重复给予时机体可能产生免疫耐受。（3）在体外获得同源重组的效率很低，并且有可能造成外源基因的丢失而丧失感染性。总之，利用重组病毒可治疗一些特殊疾病，同时探索病毒载体所面临的安全性和毒性问题[42]。但是，需要进一步改善和开发能高效转移基因、表达高度组织特异性、安全可靠的重组病毒。

4 总结与展望

通过体外连接构建重组病毒的方法，其基本过程是将含外源基因的转移载体与经过酶切处理的亲本毒株基因组DNA臂在体外同源重组，然后将连接产物转染已预先感染亲本病毒的哺乳动物细胞，这种嵌合的基因组在亲本病毒的作用下组装成为重组病毒粒子。这种技术可在DNA靶标分子的任意位点进行基因敲除、敲入、点突变等操作，利用这种方法构建重组病毒首先要满足一个基本条件，就是从亲本病毒基因组复制非必需区内找到一个唯一的限制性内切酶位点或通过基因操作技术在基因内引入适当的位点，以供外源基因的插入。TK、gE、gI基因决定病毒的毒力，为重要的毒力因子。TK基因的缺失能显著降低病毒毒力，但不影响病毒的增殖，是外源基因插入的首选位点[43]。但要在重组病毒领域有重大突破，还有大量的工作要做。首先对亲本毒株基因组的认识还有待进一步深入，其次了解亲本毒株各个基因的精确功能也很重要，基于感染重组病毒疫苗应用到自然宿主以后，有可能发生毒力返强的现象。另外，重组病毒毒株在自然环境下能否与流行毒株发生基因组交换或重组，也是需要考虑的。

重组病毒可用于基因治疗、活载体疫苗、转基因动物、基因功能研究等领域，以病毒为载体构建重组病毒有助于蛋白的体外表达及功能研究，同时对研究病毒的致病機理和研制活载体疫苗都有积极作用[44]。近些年，科研人员对重组病毒进行了大量的研究，重组病毒技术得以不断成熟和完善，进一步提高了重组病毒的安全性，优化了不同表达盒及病毒载体。另外，多价载体疫苗将是未来疫苗开发研究的主要方向之一，构建一个成功而实用的重组病毒疫苗，并进行动物免疫试验，实现一针多效，达到免疫接种的目的，为下一步商业化疫苗奠定了坚实的理论基础。总之，随着病毒分子生物学研究不断深入和研究方法不断更新，重组病毒将取得更大的突破，有望获得更广泛的应用前景。

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