玉米皮类黄酮超声波提取工艺优化及其抗氧化活性研究

2017-03-21 02:15王鹏郭丽周凤超
江苏农业科学 2016年11期
关键词:响应面法类黄酮超声波

王鹏+郭丽+周凤超

摘要:以玉米皮为原料,分析液料比、乙醇体积分数、提取温度和超声时间等单因素对类黄酮得率的影响,利用响应面法优化超声波辅助提取类黄酮物质工艺,优化玉米皮制备天然抗氧化剂的提取工艺;通过测定所提取类黄酮物质的清除自由基能力,评价玉米皮类黄酮物质的抗氧化活性。结果表明:玉米皮类黄酮物质提取的最佳工艺条件为料液比1 g ∶25 mL、乙醇体积分数50%、提取温度33 ℃、超声时间57 min,类黄酮物质的得率为12.96 mg/g;在优化条件下,类黄酮物质得率的试验验证值与预测值误差在±1.0%之内。在上述优化工艺前提下,发现玉米皮类黄酮物质对DPPH自由基、羟自由基、超氧阴离子自由基均具有较强清除作用,其半数抑制浓度分别为8.436、0.825、0.621 mg/mL。

关键词:玉米皮;类黄酮;响应面法;超声波;抗氧化

中图分类号: R284.2 文献标志码: A

文章编号:1002-1302(2016)11-0337-04

玉米是禾本科蜀黍属一年生草本植物,我国玉米产量位居世界第2位,其中玉米皮作为玉米深加工的副产物,年产量可达到2 000万t。玉米皮的综合利用,多以饲料为主。近年来,玉米皮的开发利用集中在功能性物质的提取方面,有研究者从玉米皮中提取了多肽、多糖、黄色素等功能性物质[1-3]。研究发现,在玉米等禾本科植物细胞壁中含有一定量的阿魏酸、对香豆酸、芥子酸等类黄酮物质[4],在细胞壁中与多糖和木质素进行交联。这些类黄酮物质具有许多生理功能,如清除自由基、抗紫外线辐射、抗血栓、降血脂、防治冠心病、抗菌消炎、止痛、抗突变、防癌、增强精子活力以及调节人体免疫功能等[5-7]。超声波提取技术广泛应用于植物类原料类黄酮物质的提取工艺中,该技术利用超声波具有的机械效应、热效应和空化效应,通过破坏细胞组织、增大提取溶剂分子的运动速度和穿透力以获得生物有效成分,具有提取时间短、效率高的优势[8-10]。本试验采用响应面法优化超声波辅助提取玉米皮类黄酮物质工艺,并进一步研究玉米皮类黄酮物质的抗氧化活性,以期为开发利用类黄酮等天然抗氧化剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玉米皮:购自黑龙江省绥化市望奎县,分离、粉碎成粉后过20目筛。

试剂:1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)、芸香苷、三羟基氨基甲烷(Tris)均购自美国Sigma-Aldrich公司,维生素C、邻二氮菲、FeSO4、邻苯三酚、无水乙醇均为分析纯。

1.2 仪器

KQ-200VDE型双频数控超声波清洗器,购自昆山市超声仪器有限公司;TU1901紫外-可见分光光度计,购自北京普析通用仪器有限责任公司;FW100高速万能粉碎机,购自天津市泰斯特仪器有限公司;XT120A电子天平,购自瑞士普利赛斯有限公司;GL-16G-Ⅱ冷冻离心机,购自上海安亭科学仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 玉米皮类黄酮物质的提取 准确称取2.0 g玉米皮粉,加入乙醇溶液,放入功率180 W、45 kHz超声波清洗仪中,在不同温度和时间下超声处理提取类黄酮,以3 000 r/min离心10 min,上清液为玉米皮类黄酮提取液。

1.3.2 类黄酮物质含量的测定 采用Chun等的方法[11]测定玉米皮类黄酮物质含量。精确吸取芦丁标准溶液体积分别为0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL,置于10 mL比色管中。加入0.4 mL 5%亚硝酸钠溶液摇匀,放置6 min,再加入0.4 mL 10%氯化铝溶液,摇匀,放置6 min,加入4.0 mL 4%氢氧化钠溶液,加蒸馏水稀释至刻度,摇匀后放置15 min。使用紫外-可见分光光度计在510 nm测定吸光度,并绘制标准曲线。所得标准曲线方程为:y=0.029 900x-0.013 623(r2=0.990 4)。取一定稀释倍数的样品溶液按标准曲线制作方法测定吸光度,利用标准曲线计算样品中类黄酮含量。

1.3.3 玉米皮类黄酮物质提取工艺优化

1.3.3.1 单因素试验 研究料液比、乙醇体积分数、提取温度和超声时间对玉米皮类黄酮物质提取得率的影响。料液比分别取1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30、1 ∶35(g ∶mL);乙醇体积分数分别取20%、30%、40%、50%、60%、70%;提取温度分别为20、30、40、50、60 ℃;超声时间分别为0、30、60、90、120 min。

1.3.3.2 响应面试验 在单因素试验基础上,以X1料液比、X2乙醇体积分数、X3提取温度、X4超声时间为自变量,以玉米皮类黄酮物质提取得率Y为响应值,设计4因素3水平的响应面优化试验。因素水平选取见表1。

1.3.4 抗氧化特性分析 响应面试验的结果获得了最佳提取条件,在此基础上制备玉米皮类黄酮物质提取液,以维生素C为对照,分析玉米皮类黄酮物质抗氧化特性。

1.3.4.1 DPPH自由基清除能力的测定 DPPH自由基清除率的测定参照Yamaguchi等的方法[12]进行。精确称取 4 mg DPPH自由基,用无水乙醇溶解并定容于250 mL棕色容量瓶中,配制成1×10-4 mol/L的DPPH自由基溶液,于0~4 ℃ 避光保存,备用。分别取2 mL待测提取溶液与2 mL DPPH溶液均匀混合,在黑暗中放置30、60 min后,于517 nm波长处测定2次吸光度,空白处理以无水乙醇取代样品,2次重复。DPPH自由基清除率可表示为:

2 结果与分析

2.1 玉米皮类黄酮物质提取单因素试验

以乙醇体积分数50%、提取温度40 ℃、超声时间60 min为提取条件,研究料液比对玉米皮类黄酮物质得率的影响(图1-A)。随着料液比的变大,玉米皮类黄酮得率呈现先增加后下降的趋势,在料液比为1 g ∶25 mL时得率最大,類黄酮物质从原料中溶出最多。从节约溶剂角度考虑,选择料液比的研究范围为 1 g ∶(20~30) mL。

以料液比1 g ∶25 mL、提取溫度40 ℃、超声时间60 min为提取条件,研究乙醇体积分数对玉米皮类黄酮物质得率的影响(图1-B)。随着乙醇体积分数的增加,玉米皮类黄酮物质得率呈现先增加后下降的趋势,在乙醇体积分数为50%时得率最大,不同体积分数的乙醇极性不同,因而对类黄酮物质的溶解能力也有所不同[10]。

以料液比1 g ∶25 mL、乙醇体积分数50%、超声时间 60 min 为提取条件,研究温度对玉米皮类黄酮物质得率的影响(图1-C)。随温度的升高,玉米皮类黄酮物质得率呈现先升高后下降的趋势,在30 ℃时,玉米皮类黄酮物质得率最高。温度大于30 ℃类黄酮物质得率降低,可能是乙醇挥发使液料比发生变化影响得率,也可能是温度高使类黄酮物质的化学结构被破坏影响类黄酮的得率[13]。

以料液比1 g ∶25 mL、乙醇体积分数50%、提取温度 30 ℃ 为提取条件,研究超声时间对玉米皮类黄酮物质得率的影响(图1-D)。提取60 min时类黄酮物质得率达到最大,原因是玉米皮细胞破碎,提取剂充分进入细胞内,加速了类黄酮物质的溶出。超声提取60 min后,由于长时间超声振动导致类黄酮物质结构破坏而分解,类黄酮物质得率呈现下降趋势[14-15]。

2.2 响应面优化玉米皮类黄酮物质提取工艺

在数学模型中固定2个因素,分析其他2个因素交互作用对类黄酮物质得率的影响,结果见图2。

采用Design-Expert.V8.0.6软件对回归模型进行优化,对响应面优化超声波提取玉米皮类黄酮物质工艺结果拟合分析得到最佳提取工艺条件为料液比1 g ∶25 mL、乙醇体积分数50%、提取温度33 ℃、超声时间57 min,在此条件下对类黄酮得率的预测值为12.96 mg/g。在优化条件下,验证试验中玉米皮类黄酮物质得率为12.84 mg/g,验证值与预测值误差在±1.0%之内,说明试验结果符合模型,优化的提取工艺参数是可靠的,此响应面模型具有可行性。

2.3 玉米皮类黄酮物质抗氧化性研究

对优化条件下得到的玉米皮类黄酮物质进行抗氧化性研究,以维生素C为对照,结果如表4所示,类黄酮物质对 DPPH 自由基、羟自由基、超氧阴离子自由基均具有一定的清除能力。玉米皮类黄酮物质对DPPH自由基的清除能力明显高于维生素C,对超氧阴离子自由基的清除能力与坑坏血酸相近,对羟自由基的清除能力低于维生素C。玉米皮类黄酮物质清除自由基能力的差异可能与其纯度有关。

3 结论

玉米皮类黄酮物质超声波提取工艺最佳条件为料液比 1 g ∶25 mL、乙醇体积分数50%、提取温度33 ℃、超声时间57 min,在此条件下类黄酮物质得率达到12.96 mg/g。响应面优化模型能够有效地提高玉米皮中类黄酮物质得率,在今后的研究中可再结合酶法进行工艺优化,以期得到更高的类黄酮物质得率。

玉米皮类黄酮提取物对DPPH自由基、羟自由基、超氧阴离子自由基均具有较强清除作用,半数抑制浓度分别为8.436、0.825、0.621 mg/mL。本研究结果对天然抗氧化剂的开发利用具有一定的指导意义。

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