菌糠中产纤维素酶菌株的筛选、鉴定及增殖条件响应面法优化

2017-03-21 11:12秦翠静陈宝江忻龙祚
江苏农业科学 2016年11期
关键词:枯草芽孢杆菌纤维素酶响应面法

秦翠静+陈宝江+忻龙祚

摘要:为了从菌糠中筛选高产纤维素酶的菌株,鉴定并优化其培养条件,利用纤维素刚果红筛选平板初筛,摇瓶复筛后得到菌株,鉴定后通过响应面法优化培养条件。结果表明,分离筛选得到的高产纤维素酶的菌株,经过形态观察、生理生化鉴定以及16S rRNA序列分析,初步鉴定为芽孢杆菌属枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),命名為S-4。采用响应面法对菌株S-4进行增殖条件的优化,得到3个显著因子,分别为葡萄糖添加量13.08 g/L,蛋白胨添加量 6.52 g/L,KH2PO4添加量0.37 g/L。通过响应面法优化后,活菌量比初始培养提高了34.49%。

关键词:菌糠;枯草芽孢杆菌;纤维素酶;响应面法;培养基优化

中图分类号:S816.3 文献标志码:A

文章编号:1002-1302(2016)11-0457-03

菌糠是培育食用菌后所剩的糠类物质,含有丰富的纤维素、粗蛋白等营养物质。随着我国对食用菌需求量的加大,菌糠的产量也大大增加,菌糠资源的二次利用以及环境保护等方面面临极大的挑战[1-2]。近年来的大量研究表明,利用微生物发酵菌糠可以制成微生物制剂及饲料,纤维素、木质素等被不同程度地降解,粗蛋白、粗脂肪均高于未经发酵的基质,可以缓解资源的浪费[3]。另外,将菌糠制备成益生菌制剂用于动物饲养,不仅有利于动物的消化吸收,而且降低了饲料成本[4-5]。

以往研究中的发酵菌糠所用菌株多为保藏菌种,关于菌糠中菌种利用的报道很少。本试验从菌糠中筛选出1株产纤维素酶能力强的菌株S-4,该菌株产生的纤维素酶可以更好地利用菌糠中的纤维素,降低纤维素含量。经生理生化、16S rRNA序列对比及分析鉴定,菌株S-4为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),羧甲基纤维素酶(carboxymethyl cellulase enzyme,CMCase)活力为67.5 U/ml。采用软件Design-Expert 8.0的Plackett-Burman试验筛选出对响应值影响较大的3个因素,利用最陡爬坡试验逼近最大响应区域,用Box-Behnken试验进一步优化得到最大响应值及最优增殖条件。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品 菌糠样品由河北农业大学动物科技学院提供。

1.1.2 试剂 羧甲基纤维素钠(简称CMC-Na)、酵母提取物、蛋白胨、牛肉膏均由北京奥博星有限公司提供。MgSO4·7H2O、K2HPO4、KH2PO4、葡萄糖由天津福晨化学试剂厂提供。

1.1.3 培养基 牛肉膏蛋白胨液体培养基:牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、加水补足至1 000 mL,pH值7.0~8.0,121 ℃ 灭菌20 min,备用;发酵产酶培养基:CMC-Na 10 g、KH2PO4 2 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、蛋白胨5 g、酵母粉5 g,加水补足至1 000 mL,121 ℃灭菌20 min,备用。刚果红筛选培养基:CMC-Na 2 g、(NH4)2SO4 2 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、K2HPO4 1 g、NaCl 0.5 g、刚果红0.4 g、琼脂20 g,加水补足至1 000 mL,pH值7.0,121 ℃灭菌30 min。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株筛选

1.2.1.1 富集培养 菌糠中添加2%糖蜜、1%硫酸铵、60%水,于30 ℃恒温培养箱中培养48 h。将发酵后的菌糠按 1 ∶9 的比例置于生理盐水中,静置30 min,5 000 r/min离心 5 min,将离心后得到的菌悬液进行梯度稀释,涂布后于30 ℃恒温培养箱倒置培养48 h。

1.2.1.2 产纤维素酶菌株初筛 将培养后的菌糠按1 ∶9的比例溶于生理盐水中,5 000 r/min离心5 min,将离心后得到的菌悬液进行梯度稀释,并涂布于刚果红筛选培养基上,37 ℃ 培养24 h后放置2 d,测量透明圈直径与菌落直径,挑选出透明圈直径与菌落直径比值(简称圈菌比)较大的作为初筛菌株[6-7],在刚果红初筛平板上进行划线分离纯化,并于斜面保存菌种。

1.2.1.3 产纤维素酶菌株复筛 将初筛得到的菌株接种到产酶培养基中,于37 ℃、160 r/min培养48 h,后于4 ℃、5 000 r/min 离心10 min,测定上清液的羧甲基纤维素酶活性[8]。

1.2.2 菌株鉴定

1.2.2.1 形态学特征及生理生化鉴定 观察菌株的菌落形态,革兰氏染色后观察菌株显微形态。利用细菌微量生化鉴定管进行生理生化鉴定[9]。

1.2.2.2 菌株的基因鉴定 提取菌株的基因组,并对基因组进行扩增,采用试剂盒割胶回收之后连接片段,进行热转化,对基因片段进行PCR扩增。扩增引物的合成以及测序工作由华大基因完成。得到16S序列后,在NCBI系统通过Blast进行序列比对分析,利用Mega 5.0软件的邻接法创建系统发育树[10-12]。

1.2.3 响应面法优化菌株S-4发酵条件 通过Plackett-Burman(PB)试验设计,从7个试验因素中筛选出3个显著影响因子[13-14],利用最陡爬坡试验,使因素水平值逼近最大响应区域,结合响应面法BB试验设计进一步研究,并利用Design Expert软件进行回归分析[15-16],寻求最佳水平,得到最优发酵条件[17]。

2 结果与分析

2.1 菌糠筛菌

由表1可知,圈菌比最大的菌株S-4为产纤维素酶能力最强的菌株。

摇瓶发酵复筛结果显示,菌株S-1、S-4的CMC活性分别为22.4、67.5 U/mL(表2)。综合圈菌比和CMC活性可知,S-4为目的菌株。

2.2 菌株S-4的鉴定

2.2.1 形态学特征及生理生化鉴定 形态观察表明,菌株 S-4 菌落形态为圆形,边缘不整齐,表面褶皱,干燥不透明,白色;液体培养形成菌膜,分层明显;经过染色后,油镜下观察到菌体形态为杆状,单个排列,革兰氏染色阳性,有芽孢。表3为菌株S-4的生理生化鑒定结果。

2.2.2 菌株的分子鉴定 提取菌株S-4的基因,进行PCR扩增,扩增产物进行琼脂糖电泳。S-4菌株16S rRNA序列的扩增产物约为1 500 bp。序列信息在NCBI进行Blast比对,S-4菌株16S rRNA序列与枯草芽孢杆菌的16S rRNA序列同源性为97%。从系统进化发育树分析可知,菌株S-4与枯草芽孢杆菌的16S rRNA序列相似度最高(图1)。结合序列对比分析,初步判断菌株S-4为枯草芽孢杆菌。

2.3 响应面法优化菌株S-4发酵条件

2.3.1 PB试验 以枯草芽孢杆菌S-4为试验菌株,以菌悬液D546 nm为响应值,于37 ℃、160 r/min摇床发酵,分析影响发酵的7个因素:A,葡萄糖;B,酵母粉;C,KH2PO4;D,K2HPO4;E,MgSO4;F,蛋白胨;G,牛肉膏。由表4可见,该模型相关性极显著(P值=0.000 1<0.01),在90%的置信区间内,对于活菌量影响显著的3个因素依次为A:葡萄糖,F:蛋白胨,C:KH2PO4,以此作进一步的响应面分析。

2.3.2 最陡爬坡试验 根据一阶方程,确定其变化的步长以及方向,试验组合设计及结果见表5,可见第2组的Y值(D546 nm),即发酵后菌液中菌种生物含量最高。因此, 将葡萄糖含量12 g/L、蛋白胨含量6 g/L、KH2PO4含量0.4 g/L作为后续响应面Box-Behnken试验的中心点。

2.3.3 响应面Box-Behnken试验 在本研究的条件和方法的基础上,将A(葡萄糖12 g/L)、B(蛋白胨6 g/L)、C(KH2PO4 0.4 g/L)作为Box-Behnken试验的中心点,采用Design Expert 8.0软件对Box-Behnken试验结果进行方差分析和二次多项拟合。由表6可知,模型的P值=0.000 4,此模型高度显著,可信度高。A、C、AB、BC、A2、B2、C2对响应值都有显著影响,表明3个因素对响应值不是简单的线性关系。另外模型的R2=0.966 2,校正R2=0.913 7,说明该模型可以很好地模拟和验证试验的结果。变异系数为1.77%,置信度比较高,说明模型可以反映真实的试验值。

2.3.4 响应面分析 采用响应面法分析研究培养基成分,将PB试验、最陡爬坡试验、Box-Behnken试验结合。结果显示,当3个显著因子分别为葡萄糖含量为13.08 g/L、蛋白胨含量为6.52 g/L、KH2PO4含量为0.37 g/L时,优化后活菌量比初始培养提高了34.49%。由图2、图3、图4可知,AB、BC之间具有十分明显的交互作用,AC之间的交互作用较小。为了验证结果的可靠性,保证发酵条件一致,分别于基础培养基、优化后的培养基中对菌株S-4进行试验,每组3个平行,并取平均值,得到优化后的D546 nm为3.478±0.034,与响应面分析预测结果拟合良好,基础培养基D546 nm为2.586±0.026,优化后的D546 nm比初始培养的提高了34.49%。

3 讨论与结论

通过对菌糠样品富集培养,利用纤维素筛选平板初筛、摇瓶发酵复筛,得到1株高产纤维素酶的菌株S-4。经过生理生化鉴定,并结合16S rRNA序列对比分析,鉴定为枯草芽孢杆菌,CMC活性为67.5 U/mL。采用响应面法分析培养基成分得出,当3个显著因子分别为葡萄糖含量 13.08 g/L、蛋白胨含量6.52 g/L、KH2PO4含量0.37 g/L时,优化后活菌量比初始培养提高了34.49%。枯草芽孢杆菌为饲用益生菌,且高产纤维素酶,用它来发酵菌糠,不仅可以降低粗纤维的含量,还能提高蛋白含量。枯草芽孢杆菌也可以提高动物肠道内的消化利用率[18-19]。响应面法优化增殖培养条件,试验次数少,周期较短,且对影响试验的各个因素进行分析总结,分析显著影响因子之间的交互作用,是一种高效优化发酵条件的途径[20-22]。

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