地喹氯铵对脑胶质瘤细胞凋亡的影响

张芳芳 李 鑫 郭伟英

(锦州医科大学药学院，辽宁 锦州 121000)

地喹氯铵对脑胶质瘤细胞凋亡的影响

张芳芳 李 鑫1郭伟英

(锦州医科大学药学院，辽宁 锦州 121000)

目的 探讨地喹氯铵对脑胶质瘤细胞增殖、凋亡及侵袭的影响。方法 用50、100、200 μmol/L的地喹氯铵作用于脑胶质瘤细胞U251、U87、C6，作用时间分别为12、24、48、72、96 h，MTT检测细胞增殖情况。流式细胞仪检测76 μmol/L的地喹氯铵作用48 h后的脑胶质瘤细胞U251的细胞凋亡情况。Transwell小室检测地喹氯铵对脑胶质瘤细胞侵袭能力的影响。Western印迹检测细胞中PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白的表达水平。结果 50、100、200 μmol/L的地喹氯铵对U251、U87、C6脑胶质瘤细胞增殖均具有抑制作用。地喹氯铵对脑胶质瘤细胞的增殖抑制作用随着作用时间的增加而增加，随着药物作用浓度的增加而增加。地喹氯铵作用胶质瘤U251、U87、C6细胞48 h的半数抑制浓度由大到小依次为：C6>U87>U251。76 μmol/L的地喹氯铵作用后的脑胶质瘤细胞凋亡率明显高于对照组(P<0.01)。脑胶质瘤细胞经地喹氯铵作用后的侵袭细胞数明显低于对照组(P<0.01)。地喹氯铵作用后的脑胶质瘤细胞中PI3K、Akt的表达水平与对照组相比无明显差异，而p-PI3K、p-Akt的表达水平明显下降。结论 地喹氯铵对脑胶质瘤细胞增殖、侵袭能力具有抑制作用，对脑胶质瘤细胞凋亡具有促进作用，作用机制与PI3K/Akt信号通路有关。

地喹氯铵；脑胶质瘤；增殖；凋亡；侵袭

目前常用的治疗脑胶质瘤的方法是手术治疗和放疗〔1〕，但由于脑胶质瘤具有发病隐匿、生长速度快、易转移、易复发等特点，手术治疗和放疗效果仍然不理想。地喹氯铵(DECA)是一种广谱抗菌药，对分枝杆菌、革兰阴性菌、革兰阳性菌等具有抑制作用〔2〕，对口腔溃疡、扁桃体炎、咽炎、白血病等都具有治疗作用〔3〕。近年来的研究发现，DECA对膀胱癌、结肠癌细胞的增殖具有抑制作用〔4〕。本研究拟探讨DECA对脑胶质瘤细胞增殖、凋亡、侵袭的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 人脑胶质瘤细胞U251、U87、C6购自上海慧颖生物科技公司。

1.1.2 主要仪器及试剂 酶标仪，CO2培养箱，流式细胞仪，美国Thermo；水浴锅，常州华冠仪器设备有限公司；超净工作台，苏州施威克环保科技有限公司；倒置显微镜，日本尼康；DMEM培养基、PI、Annexin-V、PVDF膜、MTT、青链霉素、胰蛋白酶，美国Sigma；胎牛血清(FBS)杭州四季青有限公司；BCA蛋白浓度检测试剂盒，上海索莱宝生物科技有限公司；PI3K单克隆抗体，p-PI3K单克隆抗体，p-Akt单克隆抗体，Akt单克隆抗体，GAPDH单克隆抗体，美国Fitzgerald；辣根过氧化物标记的二抗，杭州联科生物股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 取出放置于-80℃冰箱中的冻存细胞，迅速放置于37℃水浴锅中融化细胞。1 min后观察细胞完全融化后，在细胞中加入5 ml含有10%FBS的DMEM细胞生长液，充分混合后，1 000 r/min离心10 min，在细胞中加入磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞2次，加入5 ml细胞生长液，接种于细胞培养瓶中，放在37℃，5%CO2培养箱中培养48 h。倒置显微镜下观察细胞长满后，弃去细胞生长液，在细胞中加入PBS洗涤细胞2次。加入1 ml的0.25%的胰蛋白酶，放在37℃，5%CO2培养箱中消化2 min。显微镜下观察细胞完全呈单个存在时，转移细胞悬液至离心管中。1 000 r/min离心10 min，弃去上清液，在细胞沉淀中加入适量的细胞生长液，接种于细胞培养瓶中培养。

1.2.2 MTT检测细胞增殖情况 取培养至对数生长期的脑胶质瘤细胞U251、U87、C6，小心弃掉细胞生长液，用PBS洗涤细胞2次，加入胰蛋白酶消化细胞后，1 000 r/min离心10 min，在细胞中加入适量的细胞生长液，使得每毫升细胞悬浮液中含有细胞个数为2×104个。种植于96孔细胞培养板中，在37℃，5%CO2培养箱中培养24 h。弃去细胞培养液，在细胞中加入DECA终浓度为50、100、200 μmol/L的含药培养基。放置于37℃，5%CO2培养箱中培养，培养时间分别为12、24、48、72、96 h。同时设置对照组和空白组，对照组中不加入DECA，加入等量的二甲基亚砜(DMSO)溶液。空白组中不加细胞，加入等量的药物。在细胞中加入MTT溶液150 μl，充分混匀后，放置于37℃的CO2培养箱中孵育4 h。加入DMSO溶液孵育10 min后，酶标仪检测每孔的吸光度。分析细胞增殖情况。

1.2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡结果 取处于对数生长期的脑胶质瘤细胞U251，加入胰蛋白酶消化细胞后，1 000 r/min离心10 min，在细胞沉淀中加入细胞生长液，接种于96孔细胞培养板中，调整细胞浓度使每孔中有2×105个细胞，放置于37℃，5%CO2培养箱中培养24 h。小心倒掉细胞生长液，在细胞中加入含有DECA终浓度为76 μmol/L的含药培养基，放在37℃，5%CO2培养箱中培养48 h。同时设置对照组，对照组中用DMSO溶液代替DECA。培养结束后，弃去细胞生长液，在细胞中加入胰蛋白酶消化细胞后，用PBS洗涤细胞2次。加入PBS重悬细胞，细胞浓度为2×106个/ml。收集1 ml细胞悬液中的细胞，加入500 μl的结合缓冲液，吹打混匀后，在细胞中加入Annexin V和PI各5 μl，放在室温下反应10 min后，流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.2.4 Transwell小室检测细胞侵袭能力 取出保存于-20℃的Transwell小室，在室温下放置30 min。在Transwell小室的下室加入不含FBS的细胞生长液，放置于37℃孵育2 h。取对数生长期的脑胶质瘤细胞U251，加入胰蛋白酶融化细胞后，1 000 r/min离心10 min，弃去酶消化液。在细胞沉淀中加入含有DECA 76 μmol/L不含胎牛血清的细胞生长液，使每毫升细胞悬液中含有4×104个细胞。在小室的下室加入500 μl的细胞生长液，在小室的上室加入细胞悬液600 μl，放在37℃，5%CO2培养箱中培养16 h。用棉签擦掉Transwell小室内侧的多余细胞，用结晶紫染色小室外侧部分，显微镜下观察细胞迁移情况。

1.2.5 Western印迹检测细胞中PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt的表达情况 取经76 μmol/L DECA作用48 h后的脑胶质瘤细胞U251，弃去细胞生长液，在细胞中加入PBS洗涤细胞2次。加入细胞裂解液，充分混匀后，放置于冰上裂解40 min。4℃，12 000 r/min离心10 min后，转移蛋白上清至新的EP管中。根据蛋白浓度检测试剂盒说明书检测提取的蛋白浓度。将提取的蛋白样品与Loading buffer充分混合后，放在100℃的孵育器中煮沸5 min，使蛋白充分变性。取适量的变性蛋白样品加入到上样孔中，每孔加入50 μl，电泳初始电压为80 V，电泳30 min后调整电压至120 V至电泳结束。取出蛋白凝胶按照常规方法4℃电转过夜。取出聚偏氟乙烯(PVDF)膜，以5%脱脂奶粉为封闭液在37℃封闭90 min。Tris盐酸缓冲液(TBST)洗膜3次，依次与一抗、二抗孵育反应后，在暗室中曝光，分析蛋白表达含量。

1.3 统计学方法 应用SPSS22.0软件行方差分析。

2 结 果

2.1 MTT检测细胞增殖结果 50、100、200 μmol/L的DECA对U251、U87、C6脑胶质瘤细胞增殖均具有抑制作用。DECA对脑胶质瘤细胞的增殖抑制作用随着作用时间增加而增加，随着药物作用浓度增加而增加。计算DECA作用U251、U87、C6细胞48 h的半数抑制浓度依次为(76.32±6.38)μmol/L、(89.65±9.47)μmol/L、(106.89±10.24)μmol/L。DECA作用于胶质瘤U251、U87、C6细胞48 h的半数抑制浓度由大到小依次为：C6>U87>U251。见图1。

与0 μmol/L比较:1)P<0.05，2)P<0.01；下图同图1 DECA对脑胶质瘤细胞增殖影响结果

2.2 流式细胞仪检测细胞凋亡 76 μmol/L的DECA作用后的脑胶质瘤细胞凋亡率〔(39.87±4.29)%〕明显高于对照组〔(11.24±1.32)%〕(P<0.01)。

2.3 Transwell 小室检测细胞侵袭结果 胶质瘤细胞经DECA作用后的侵袭细胞数(139±15)明显少于对照组(342±21)(P<0.01)。

2.4 Western印迹检测细胞中PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt的表达结果 DECA作用后的脑胶质瘤细胞中PI3K、Akt的表达水平与对照组相比无明显差异，而p-PI3K、p-Akt的表达水平明显下降。见图2。

图2 DECA对脑胶质瘤细胞蛋白表达的影响

3 讨 论

由于脑胶质瘤具有易转移、易复发等特点，手术治疗和化疗后患者的平均生存期仅有10个月〔5〕。

DECA属于季铵类表面活性剂，是人工合成的含有两个喹啉芳杂环的喹啉衍生物，具有广泛的抑菌作用，早期主要用来治疗口腔炎症。DECA通过作用于微生物体内的相关蛋白酶调控其糖酵解的过程，发挥杀菌抑菌的作用〔6〕。DECA对肺癌细胞具有明显的增殖抑制作用，通过调控凋亡相关因子促进癌细胞的凋亡〔7〕。

细胞以分裂的方式进行增殖。正常情况下，细胞增殖和细胞凋亡是一个动态平衡的过程〔8〕。细胞凋亡是一种自然状态下的细胞死亡。这种死亡受多种基因严格调控，由多种因子共同作用经过一系列复杂的过程而产生的。细胞凋亡是机体维持内环境稳定的一种方式，是多细胞生命体消除多余或者异常细胞的一种重要途径〔9〕。在癌症的发生过程中，癌细胞的侵袭能力是癌症发展的重要前提，是肿瘤向周围组织侵犯的过程〔10〕。本研究中，MTT检测结果显示，DECA对脑胶质瘤细胞增殖具有抑制作用，且对脑胶质瘤细胞的增殖抑制作用随着作用时间和作用浓度的增加而增加。流式细胞仪检测结果显示，DECA对脑胶质瘤细胞凋亡具有促进作用。Transwell小室检测结果说明，DECA对脑胶质瘤细胞的侵袭能力具有明显的抑制作用。

在细胞增殖凋亡侵袭过程中，多种蛋白参与了这一系列复杂的过程，其中磷酸肌醇激酶(PI3K)/Akt信号通路在癌细胞增殖、凋亡、侵袭过程中发挥重要作用〔11〕。PI3K是一种原癌基因，可以激活磷脂酰肌醇和肌醇〔12〕。Akt是蛋白激酶B的另一种叫法〔13〕。这两种激酶组成的PI3K/Akt信号通路参与癌细胞的增殖、凋亡和侵袭过程〔14〕。Western印迹结果说明，DECA对脑胶质瘤细胞的作用机制是通过抑制PI3K/Akt信号通路作用的。

综上所述，DECA对脑胶质瘤细胞增殖、侵袭具有抑制作用，对脑胶质瘤细胞凋亡具有促进作用，作用机制与PI3K/Akt信号通路有关。

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〔2016-06-15修回〕

(编辑 袁左鸣)

辽宁省自然科学基金(No.2014022044)

郭伟英(1958-)，男，教授，硕士，主要从事药物分析研究。

张芳芳(1985-)，女，在读硕士，主要从事药学研究。

R739.4

A

1005-9202(2017)04-0822-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.04.016

1 锦州医科大学附属第一医院药品管理科