核呼吸因子1表达与乳腺癌发生发展、临床病理特征及Ki-67表达的关系

罗 莉 唐东昕 王镜辉 郭 斌 李 军 黄雯琪 张 兰 王雅杰

(中国人民解放军第二军医大学，上海 200433)

核呼吸因子1表达与乳腺癌发生发展、临床病理特征及Ki-67表达的关系

罗 莉 唐东昕1王镜辉1郭 斌1李 军1黄雯琪1张 兰1王雅杰

(中国人民解放军第二军医大学，上海 200433)

目的 探讨核呼吸因子(NRF)-1在乳腺癌组织中的表达及与患者临床病理特征、Ki-67表达的关系。方法 选取手术切除后经病理学证实为乳腺癌的117例患者的癌组织标本(乳腺癌组)、60例乳腺良性疾病患者的乳腺组织(良性组)，分别采用EnVision染色法进行检测，观察两组标本中NRF-1蛋白、Ki-67蛋白的表达及二者相关性。结果 乳腺癌组织中的NRF-1阳性表达率(76.07%)显著低于良性组(100.00%)(P<0.05)，Ki-67阳性表达率(79.49%)显著高于良性组(20.00%)(P<0.05)。 乳腺癌组织中的NRF-1阳性表达与组织学分级、TNM分期、发生淋巴结转移具有显著的关系(P<0.05)。乳腺癌组织中的NRF-1与Ki-67蛋白的表达呈现显著的负相关(r=-0.868，P<0.001)。结论 乳腺癌患者的NRF-1、Ki-67表达发生异常，NRF-1表达与患者的临床病理特征、Ki-67表达具有显著的相关性。

核呼吸因子；乳腺癌

乳腺癌特别是侵袭性乳癌严重威胁了女性的生命健康，包括炎性乳癌在内的恶性程度较高的肿瘤往往较早出现侵袭转移。虽然临床上通过根治性乳腺切除联合淋巴结清扫可以在一定程度上延长术后中位生存时间，但总体治疗效果仍然不佳。多数患者临床确诊乳腺癌已出现明显的腋窝淋巴结或者胸骨旁淋巴结转移，严重影响了患者临床预后〔1〕。近年来对于乳腺癌的相关淋巴结转移、局部侵袭等淋巴特征的研究逐渐转向基因水平的差异性探讨。有研究表明乳腺癌组织细胞有氧氧化明显降低，而糖酵解途径等无氧代谢比例明显增加〔2〕，线粒体能量代谢的平衡和调控参与到了乳腺癌细胞能量代谢的平衡维持过程。核呼吸因子(NRF)-1近年来被发现在多种恶性肿瘤细胞中异常表达，并可能参与到了线粒体能量代谢调控中〔3〕。本文旨在探讨NRF-1在乳腺癌组织中的表达及与患者的临床病理特征、Ki-67表达的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取手术切除后经病理学证实为乳腺癌的117例患者的癌组织标本(乳腺癌组)、60例乳腺良性疾病患者的乳腺组织(良性组)。乳腺癌组117例，年龄35～68〔平均(52.4±9.5)〕岁，肿瘤部位：右侧58例、左侧59例，肿瘤最大径：≤2 cm 46例、>2 cm 71例；浸润性导管癌72例、非浸润性导管癌45例；TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期56例，Ⅲ+Ⅳ期61例。良性组60例，年龄28～70岁，平均(54.1±9.0)岁，其中乳腺纤维瘤30例、腺瘤16例、腺病14例。两组研究对象的年龄构成无统计学差异(P>0.05)。纳入标准：(1)所有乳腺癌组织均来源于本院甲乳腺外科手术后病理学检查证实为乳腺癌的患者，乳腺良性疾病来源于活组织病检或手术切除后；(2)两组患者手术前均未接受放疗、化疗等治疗；(3)所有纳入乳腺癌患者的临床资料齐全。排除标准：(1)转移性乳腺肿瘤患者；(2)合并其他部位肿瘤疾病的患者；(3)研究所需相关资料不全的患者。

1.2 免疫组化方法及结果判定

1.2.1 免疫组化方法 石蜡切片脱蜡和水化后，高压锅抗原修复，每张切片滴加l滴3%过氧化氢溶液,室温下孵育。每张切片滴加1滴NRF-1抗体37℃孵育60 min，每张切片滴加1滴二抗,室温孵育，二氨基联苯胺(DAB)显色,苏木素复染,脱水,透明,封片。EnVisino试剂盒为Zymde公司产品。兔抗NRF-1多克隆抗体购自Santa Cruz公司,按照NRF-l抗体说明书要求，以正常肾小球作为阳胜对照,磷酸盐缓冲液(PBS)替代一抗作为阴性对照。Ki-67抗体购自福州迈新公司,用已知的Ki-67胃癌切片作为阳性对照,PBS替代一抗作为阴性对照。

1.2.2 免疫组化结果判定 NRF-1蛋白、Ki-67蛋白的阳性着色表达于细胞核，呈黄色、棕黄色、褐色表达，(1)根据着色强度：0分为无色、1分为淡黄色、2分为棕黄色、3分为褐色、黑色；(2)根据阳性细胞比例：阳性细胞数目所占比例<10%为1分、阳性细胞所占比例11%～50%为2分、阳性细胞数51%～75%为3分、阳性细胞数所占比例>75%为4分，两种积分相乘总分<3分为阴性、≥3分为阳性。(-)为总分<3分，阴性表达；(+)为3～5分，弱阳性表达；()为6～9分，中阳性表达；()为>9分，强阳性表达。

1.3 统计学方法 采用SAS9.0软件，组间比较采用χ2检验，相关性分析采用Spearman秩相关分析法。

2 结 果

2.1 两种乳腺组织中的NRF-1和Ki-67蛋白表达情况 乳腺癌组织中的NRF-1阳性表达率(76.07%)显著低于良性组(100.00%，P<0.05)，Ki-67阳性表达率(79.49%)显著高于良性组(20.00%，P<0.05)。见图1，图2。

图1 NRF-1蛋白在乳腺癌和乳腺 良性组织中的表达(SP，×400)

图2 Ki-67蛋白在乳腺癌和乳腺良性组织中的表达(SP，×400)

2.2 乳腺癌组织中的NRF-1蛋白表达与患者临床病理特征的关系 乳腺癌组织中的NRF-1阳性表达与乳腺癌患者的组织学分级、TNM分期、发生淋巴结转移具有显著的关系(P<0.05)。见表1。

2.3 乳腺癌组织中的NRF-1与Ki-67表达的相关性分析 乳腺癌组织中的NRF-1与Ki-67蛋白表达呈显著负相关(r=-0.868，P<0.001)。

表1 乳腺癌组织中的NRF-1蛋白表达与 患者临床病理特征的关系〔n(%)〕

3 讨 论

恶性肿瘤细胞中线粒体基因异常扩增，导致线粒体内有氧氧化过程与糖酵解途径过程比例显著改变，糖酵解过程产生的三磷酸腺苷(ATP)增加。有研究表明，线粒体能量代谢平衡的紊乱参与到了恶性上皮性肿瘤的侵袭、淋巴结转移和免疫逃逸。线粒体自身基因以及细胞核相关转移调控基因均参与到了这一过程，而近年来基础研究重点关注了NRF-1异常扩增导致的线粒体能量代谢紊乱。NRF-1最早发现为细胞色素C表达的激活转录因子，后来发现NRF-1不仅转录调控mTtFA的表达,而且也转录调节许多核编码线粒体呼吸功能所需要的基因,包括乳酸脱氢酶、硫加氧酶、二磷酸腺苷以及脱氨基转移酶等〔4〕。肿瘤细胞氧化呼吸链产生的能力通过铁硫蛋白传递电子产生ATP，研究表明NRF-1显著影响了肝癌、结肠癌以及部分膀胱移行细胞癌中铁硫蛋白传递电子产生ATP的偶联过程，抑制了ATP的产生，并促进无氧氧化过程，导致体内酸性代谢毒物增多〔5〕。肿瘤细胞能量代谢紊乱将进一步促进肿瘤细胞异常增殖、淋巴结侵袭破坏和局部转移等过程。

NRF-1作为细胞核呼吸因子，在乳腺癌组织中异常高表达，组织学染色可见乳腺癌组织中的NRF-1阳性表达率明显高于正常对照乳腺组织，EnVision染色可见NRF-1主要定位于细胞核周边，染色较为均一，且均呈现出一致性高强度染色。NRF-1在乳腺癌中的高表达提示了其可能参与了乳腺癌发生发展过程，NRF-1对于下游HES转录因子、细胞核内第二信使钙离子结合蛋白等的调节作用，可以平衡异常线粒体基因突变导致的氧化磷酸化或者偶联磷酸化过程障碍〔6〕，改善线粒体有氧氧化产能，从而调控细胞增殖〔7〕。有研究表明，NRF-1在结肠癌以及肝癌中的异常表达与癌组织的局部侵袭、黏膜下淋巴结转移以及远处转移有关，但其对于乳腺癌的研究较少。本研究提示NRF-1与乳腺癌的恶性相关临床特征具有负性关联。随着淋巴结转移的增多、局部侵袭的加深等病理过程，NRF-1对于细胞增殖的负性调控作用降低，NRF-1表达阳性率下降。Spearman等级分析也进一步确认了NRF-1在乳腺癌发生发展中的作用。但本研究并未发现不同大小的癌组织与NRF-1的关联，考虑NRF-1主要与细胞层面增殖、基因异常扩增有关，而与大体组织学类型无明显关联。提示了NRF-1可以作为乳腺癌术后远期预后的潜在参考指标。Ki-67表达出现于除G0、G1期早期以外的细胞周期中,在G2、M期表达最强,被认为是较理想反映细胞群体增殖活性的客观指标。本研究也提示Ki-67与NRF-1在乳腺癌的发生发展过程中可能具有完全不同的作用机制。需要注意的是，部分学者认为乳腺导管癌与乳腺小叶癌中NRF-1的表达以及相关作用机制并不相同〔8〕。

1 张海洋，冯慕华，徐 彤，等.人核呼吸因子2基因真核表达载体的构建与鉴定〔J〕.大理学院学报：综合版,2014;13(2):37-42.

2 单系金，张景华，李玉凤，等.线粒体融合蛋白2及Ras-MAP K信号通路与乳腺癌的研究进展〔J〕.临床肿瘤学杂志,2014;9(4):371-4.

3 范 华,汪 湍,宿向东,等.SIAH2蛋白表达对评估乳腺癌患者预后的临床意义〔J〕.中国医学前沿杂志(电子版),2016;8(8):76-9.

4 铁 剑，解云涛，徐 晔，等.p53基因codon 72多态性与乳腺癌术后放化疗疗效相关性分析〔J〕.中国肿瘤临床,2015;42(3):152-6.

5 李锴男，赫 军，毕经旺，等.核呼吸因子-1和Ki-67在乳腺癌组织中的表达及意义〔J〕.中国肿瘤临床,2011;38(19):1187-91.

6 Bahat A,Perlberg S,Melamed-Book N,etal.Transcriptional activation of LON Gene by a new form of mitochondrial stress:A role for the nuclear respiratory factor 2 in StAR overload response (SOR)〔J〕.Mol Cell Endocrinol,2015;408(1):62-72.

7 Satterstrom FK,Swindell WR,Laurent G,etal.Nuclear respiratory factor 2 induces SIRT3 expression〔J〕.Aging Cell,2015;14(5):818-25.

8 Ivanova MM,Luken KH,Zimmer AS,etal.Tamoxifen increases nuclear respiratory factor 1 transcription by activating estrogen receptor beta and AP-1 recruitment to adjacent promoter binding sites〔J〕.FASEB J,2011;25(4):1402-16.

〔2016-12-09修回〕

(编辑 袁左鸣)

Relationship between NRF-1 expression and breast cancer development,clinical pathology and the expression of Ki-67

LUO Li,TANG Dong-Xin,WANG Jing-Hui,etal.

The Second Military Medical University of PLA,Shanghai 200433,China

Objective To research and analyze the expression of nuclear respiratory factor (NRF)-1 in breast cancer tissue and the relationship between the expression of NRF-1 and clinicopathologic features of patients and Ki-67 expression.Methods Cancer tissue from 117 patients confirmed by pathology after surgery (breast cancer group) and benign breast tissue from 60 cases of benign breast diseases (benign group) were chosen and detected by EnVision staining. The expressions of NRF-1 and Ki-67 protein and the correlation were observed.Results The positive expression rate of NRF-1 in breast cancer (76.07%) was significantly lower than that in benign group (100%,P<0.05),and the positive expression rate of Ki-67 in breast cancer was significantly higher than that in benign group (20%,P<0.05). The positive expression of NRF-1 in breast cancer tissues was significantly related to the histological grade,TNM staging and lymph node metastasis in breast cancer patients(P<0.05). The expression of NRF-1 and Ki-67 protein in breast cancer tissues were significantly negative correlated (r=-0.868,P<0.001). Conclusions The expressions of Ki-67 and NRF-1 in patients with breast cancer are abnormal.The expression of NRF-1 is significantly correlated with the clinicopathologic features of patients and Ki-67 expression.

Nuclear respiratory factor;Breast cancer

国家自然科学基金(8156150433)；贵州省研究生工作站计划(黔教研合JYSZ字〔2014〕018)；贵州省科技支撑计划社会发展攻关项目(黔科合SY字〔2013〕3026号)；贵州省科学技术厅-贵阳中医学院科学技术联合基金项目(黔科合LH字〔2014〕7339号)

王雅杰(1963-)，女，博士，教授，博士生导师，主要从事三阴乳腺癌、消化道肿瘤及癌痛的规范化治疗研究。

罗 莉(1977-)，女，硕士，副主任医师，主要从事中医药防治肿瘤的基础及临床研究。

R73

A

1005-9202(2017)04-0901-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.04.052

1 贵阳中医学院